أسلوب لتسلسل 16S المستهدفة من عينات اللبن البشري

الهدف العام من هذه الطريقة هو تضخيم 16 SRRNA من حليب الأم وعينات أخرى منخفضة الكتلة الحيوية باستخدام بروتوكول شبه آلي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في تطور واضطرابات الميكروبيوم البشري من حيث صلتها بالصحة والمرض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها شبه آلية ، وسهلة الأداء نسبيا ، وقابلة للتكيف مع أنواع العينات المتعددة بما في ذلك الإفراز والمسحات والبراز.

بعد إذابة الحليب كامل الدسم وتحويله وفقا لبروتوكول النص ، قم بتدوير العينات عند 5000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق لحبيبات الخلايا. استخدم ملعقة بلاستيكية أو طرف ماصة كبير لإزالة الطبقة الدهنية العلوية. ثم دون إزعاج الحبيبات ، قم بإزالة كل المادة الطافية ، باستثناء 100 ميكرولتر.

باستخدام مليلتر واحد من PBS ، أعد تعليق الحبيبات واغسلها. ثم قم بإعداد عنصر تحكم سلبي عن طريق إضافة مليلتر واحد من PBS المعقم إلى أنبوب سعة خمسة ملليلتر. انقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي نظيف بسعة خمسة ملليلتر وقم بتدويره عند 5000 مرة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.

ثم استخدم طرف ماصة معقمة مصفاة سعة 1000 ميكرولتر للتخلص من الطبقة الدهنية المطفية بالكامل. لتعطيل العينة وتجانسها ، أضف 600 ميكرولتر من محلول التحلل المحتوي على بيتا ميركابتو إيثانول إلى الحبيبات وانقل المعلق إلى أنبوب خرزة. قم بإعداد عنصر تحكم إيجابي واحد باستخدام عازلة التحلل و 20 ميكرولتر من العينة الوهمية البكتيرية.

دوامة جميع أنابيب الخرزة بقوة لمدة 15 ثانية. ثم قم بتسخين العينات على دوامة يتم التحكم في درجة حرارتها عند 37 درجة مئوية و 700 إلى 800 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. قم بتحميل الأنابيب في مجموعة محول تعطيل العينة الآلي.

ثم تغلبت الخرزة على العينات عند 30 هرتز لمدة دقيقة واحدة. قم بتفكيك مجموعة المحول وتبديلها يدويا باستخدام لوحات العينة من الذراع الآلي الأيسر إلى الذراع الروبوتية اليمنى للأداة. تغلبت الخرزة على الأنابيب عند 30 هرتز لمدة دقيقة أخرى ثم قامت بالطرد المركزي للأنابيب عند 17 و 200 مرة جم و 25 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق.

باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ، قم بإزالة كل المادة الطافية ، مع الحرص على عدم أخذ أي من الطبقة الدهنية في الأعلى أو بقايا الخرز في الجزء السفلي من العينة. ضع المادة الطافية على أعمدة الخالط. ثم قم بالطرد المركزي للأعمدة بأقصى سرعة و 25 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق.

انقل 350 ميكرولتر من eluid إلى أنبوب طرد مركزي دقيق من مصنعي ملليلتر. لعزل الحمض النووي وفقا لبروتوكول النص ، قم بقطع الأغطية وتنعيم حواف أعمدة الدوران الفردية للحمض النووي والحمض النووي الريبي. أدخل عمود دوران الحمض النووي بدون أنبوب التجميع في محول الدوار.

ثم تخلص من أنبوب التجميع. بعد ذلك ، أدخل أنبوبين مليلترين دواميين في شاكر ، باتباع مخطط تحميل أداة تنقية الحمض النووي / الحمض النووي الريبي الآلي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتسمية أنابيب تجميع خمسة ملليلتر من نقطة واحدة وإدخالها في محولات الدوار.

ثم اضبط محولات الدوار في جهاز الطرد المركزي باتباع مخطط تحميل أداة تنقية الحمض النووي / الحمض النووي الريبي الآلي. بعد إدخال أطراف المرشح ، والماء الخالي من RNase ، والكواشف في كتلة كاشف الجهاز ، أغلق غطاء الأداة وقم بتشغيل برنامج تنقية الحمض النووي المخصص على الجهاز. عند اكتمال التفاعل ، اجمع العينة التي تحتوي على أنابيب من شاكر ، وإذا تركت أي عينة ، فقم بتخزينها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر للتخزين على المدى القصير أو 80 درجة مئوية تحت الصفر للتخزين طويل الأجل.

بعد تحضير منطقة العمل ، والمزيج الرئيسي ل PCR ، وفقا لبروتوكول النص ، قم بتحميل 50 إلى 100 ميكرولتر من عينات الحمض النووي في محول عينة أداة مكون من 32 بئرا ، باتباع خريطة اللوحة المكونة من 96 بئرا. لكل لوحة PCR ، قم بإعداد عنصرين من عناصر التحكم السلبية عن طريق سحب 30 ميكرولترا من ماء PCR في أنبوب تجميع نظيف بنقطة واحدة وخمسة ملليلتر. ثم ضع جميع العينات على محول عينة الأداة المكون من 32 بئرا مع أغطية مقفلة في الوضع المفتوح.

في محول كاشف الجهاز ، قم بإزالة غطاء كل برايمر عكسي بأرقام رمز شريطي محددة واحدا تلو الآخر. لتحميل معالج السائل الآلي ، ضع محول الكاشف في موضعه B1.In الترتيب لتجنب تأثير الحافة ، ضع إحدى حواف المحول بعناية على جانب المقبض وقم بإزالة الحافة الأخرى ببطء. تأكد من الضغط على جميع زوايا المحولات.

ضع محول العينة في الموضع C1 ، مع التأكد من الضغط على جميع زوايا المحولات. ثم دوامة مزيج رئيسي سعة خمسة ملليلتر. افتح الغطاء وضعه في الموضع A على المزيج الرئيسي للأداة وكتلة الكاشف.

ضع لوحة PCR على محول الجهاز المكون من 96 بئرا والذي يهدف إلى حمل لوحات PCR نصف حواف. ثم ابدأ التشغيل واحفظه كملف جديد. عند اكتمال التشغيل، تحقق من عدم وجود أخطاء.

ثم استخدم 12 أو ثمانية أغطية شريطية لإغلاق اللوحة. دوامة بقوة واستخدم لوحة دوارة 96 بئرا لتدوير الألواح لمدة دقيقة واحدة. أخيرا ، ضع اللوحة على الجليد حتى يتم نقلها إلى غرفة التضخيم اللاحقة وتحميلها على الدراجة الحرارية.

بعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإجراء مراقبة الجودة وإعداد المكتبة وفقا لبروتوكول النص. تتبع خطوة مراقبة الجودة الأولى للبروتوكول تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لمنطقة 16SV4. كما هو موضح هنا ، تم تحليل ميكرولتر واحد من منتج PCR من كل عينة عن طريق الرحلان الكهربائي للتأكد من أنه كان ضمن نطاق الحجم المتوقع من 350 إلى 450 زوجا أساسيا.

أنتجت بعض عينات الحليب البشري كميات أقل من منتج معين ، مما يشير إما إلى مستويات منخفضة من الحمض النووي الميكروبي المستخرج في تلك العينات أو ترحيل مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل أثناء الاستخراج. كان القياس الكمي لمنتج معين لكل عينة ضروريا لتحديد حجمه المطلوب للتجميع المولي المتساوي للعينات للتسلسل. عادة ما يهيمن منتج PCR معين على المكتبة المجمعة للتسلسل المستهدف.

إذا كان هناك قدر كبير من المنتجات غير المحددة في المكتبة ، فيجب إضافة خطوة تنقية الهلام إلى سير العمل. تظهر نتائج التسلسل تنوعا عاليا في الأصناف المرتبطة بميكروبيوم حليب الأم والتباين في عدد أعداد القصب المتتسلسل لكل عينة. في المقابل ، كانت تركيبة الأصناف وعدد القصب للمحاكاة البكتيرية قابلة للمقارنة مع النتائج التي تم الحصول عليها للوهمية في عمليات سير العمل السابقة ، مما يشير إلى أن التباين الملحوظ لعينات الحليب البشري هو نتيجة تجريبية أصلية وليست دالة لتباين سير العمل الجوهري.

في حالة ترك جهاز التسلسل قيد التشغيل طوال الليل ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون يومين ، من 12 إلى 24 عينة ، إذا تم تضخيم جميع العينات في تشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل الأولي. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فستكون هناك حاجة إلى يوم آخر من الصدفة. عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم السفر فقط من منطقة ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى منطقة ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل لتجنب التلوث.

من الأهمية بمكان أيضا تغيير القفازات بشكل متكرر لتجنب أي تلوث متبادل. لا تنس أن العمل مع العينات البشرية يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما استخدام الاحتياطات ، مثل معدات الحماية المناسبة وخزانات السلامة الحيوية.