Name: أسلوب لتسلسل 16S المستهدفة من عينات اللبن البشري (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: تعلم تسلسل 16S المستهدف من عينات اللبن البشري منخفضة الكتلة الحيوية باستخدام بروتوكول شبه آلي. يُبسط هذا الأسلوب تحليل الميكروبيوم ويساعد الباحثين على دراسة دوره في الصحة والمرض.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نود أن نشكر هيلتي أديسيتييو، دكتوراه، وشانجكسين يانغ، دكتوراه لتطوير البروتوكول. وقدمت الدعم الشامل للدولي الأمهات طب الأطفال المراهقين الإيدز السريرية المحاكمات المجموعة (إيمباكت) "المعهد الوطني للحساسية" والأمراض المعدية (نييد) من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) ضمن "أرقام جائزة" UM1AI068632 (خط إيمباكت)، UM1AI068616 (إيمباكت سدمك) و UM1AI106716 (LC إيمباكت)، بتمويل مشترك من يونيس كينيدي شرايفر المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (NICHD) والمعهد الوطني للصحة العقلية (NIMH). المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

<ol><li>Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+the+human+gut+microbiota+for+effector+strains+that+shape+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system.</a> Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).</li>
<li>Postler, T. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Holobiont%3A+How+Microbial+Metabolites+Affect+Human+Health+and+Shape+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System.</a> Cell Metab. , (2017).</li>
<li>Hall, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-personal+diversity+and+temporal+dynamics+of+dental%2C+tongue%2C+and+salivary+microbiota+in+the+healthy+oral+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2(2017).</li>
<li>Perez Perez, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+Site+Is+a+More+Determinant+Factor+than+Human+Population+Diversity+in+the+Healthy+Skin+Microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome.</a> PLoS One. 11 (4), e0151990(2016).</li>
<li>Hamady, M., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+community+profiling+for+human+microbiome+projects%3A+Tools%2C+techniques%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges.</a> Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).</li>
<li>Human Microbiome Project, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+human+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A framework for human microbiome research.</a> Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+methods+and+dodging+pitfalls+in+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research.</a> Microbiome. 5 (1), 52(2017).</li>
<li>Hugerth, L. W., Andersson, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+Microbial+Community+Composition+through+Amplicon+Sequencing%3A+From+Sampling+to+Hypothesis+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing.</a> Front Microbiol. 8, 1561(2017).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li>
<li>Pannaraj, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+Between+Breast+Milk+Bacterial+Communities+and+Establishment+and+Development+of+the+Infant+Gut+Microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome.</a> JAMA Pediatr. , (2017).</li>
<li>Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colostral+and+breast+milk+cells.+A+light+and+electron+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Paediatr+Scand%22%5BJournal%5D)">Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study.</a> Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).</li>
<li>Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+studies+on+the+T-lymphocyte+population+of+human+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk.</a> J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).</li>
<li>Sabbaj, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus-specific+CD8%28%2B%29+T+cells+in+human+breast+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk.</a> J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).</li>
<li>Jimenez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+Analysis+of+Milk+of+Healthy+and+Mastitis-Suffering+Women%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hum+Lact%22%5BJournal%5D)">Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women.</a> J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).</li>
<li>Ghosh, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+breast+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk.</a> J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).</li>
<li>Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+DNA%2FRNA+Co-extraction+Workflow+Protocol+Suitable+for+Inhibitor-Rich+Environmental+Samples+That+Focuses+on+Complete+DNA+Removal+for+Transcriptomic+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses.</a> Front Microbiol. 7, 1588(2016).</li>
<li>Bender, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+HIV+infection+influences+the+microbiome+of+HIV-uninfected+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants.</a> Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100(2016).</li>
<li>Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+the+human+microbiome+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Sequencing the human microbiome in health and disease.</a> Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).</li>
<li>Lauder, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+placenta+samples+with+contamination+controls+does+not+provide+evidence+for+a+distinct+placenta+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota.</a> Microbiome. 4 (1), 29(2016).</li>
<li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biol. 12, 87(2014).</li>
<li>Walker, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((16S+rRNA+gene-based+profiling+of+the+human+infant+gut+microbiota+is+strongly+influenced+by+sample+processing+and+PCR+primer+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice.</a> Microbiome. 3, 26(2015).</li>
<li>Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherent+bacterial+DNA+contamination+of+extraction+and+sequencing+reagents+may+affect+interpretation+of+microbiota+in+low+bacterial+biomass+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Pathog%22%5BJournal%5D)">Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples.</a> Gut Pathog. 8, 24(2016).</li>
<li>Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+bias+of+illumina-based+bacterial+16S+rRNA+gene+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles.</a> Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).</li>
<li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+down+the+sources+of+experimental+contamination+in+microbiome+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies.</a> Genome Biol. 15 (12), 564(2014).</li>
<li>Aho, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiome+of+the+human+lower+airways%3A+a+next+generation+sequencing+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22World+Allergy+Organ+J%22%5BJournal%5D)">The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective.</a> World Allergy Organ J. 8 (1), 23(2015).</li>
<li>Charlson, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographical+continuity+of+bacterial+populations+in+the+healthy+human+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract.</a> Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).</li>
<li>Bittinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+characterization+of+medically+relevant+fungi+in+the+human+respiratory+tract+using+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing.</a> Genome Biol. 15 (10), 487(2014).</li>
<li>Jervis-Bardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+accurate+microbiota+profiles+from+human+samples+with+low+bacterial+content+through+post-sequencing+processing+of+Illumina+MiSeq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data.</a> Microbiome. 3, 19(2015).</li>
<li>Knights, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bayesian+community-wide+culture-independent+microbial+source+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking.</a> Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).</li>
<li>Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decontamination+of+16S+rRNA+gene+amplicon+sequence+datasets+based+on+bacterial+load+assessment+by+qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR.</a> BMC Microbiol. 16, 73(2016).</li>
<li>Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Genetics+and+Gut+Microbiome%3A+Challenges+and+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives.</a> Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).</li>
<li>ATCC. Mock microbial communities. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1">https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1</a> (2017).</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

تستهدف الجيل التالي تسلسل الرنا الريباسي 16S تقنية تستخدم على نطاق واسع وسريع ل توصيف ميكروبيومي18. ومع ذلك، العديد من العوامل، بما في ذلك الآثار دفعة والتلوث البيئي، والتلوث عبر العينة، حساسية وإمكانية تكرار نتائج يمكن أن تضر بالنتائج التجريبية وارباك على تفسير7،19 , 20-يجب أن تتضمن ميكروبيومي مهام سير العمل لتسهيل أفضل التحليلات 16S قوية، جيدة التصميم التجريبي، استخدام عناصر تحكم مناسبة الفصل المكاني لخ...

يعتقد أن المجتمعات الميكروبية التي استعمار البشر أن تكون الأهمية لصحة الإنسان، والأمراض التي تؤثر على الأيض والتنمية محصنة والتعرض للمرض، والردود على التطعيم والمخدرات العلاج1، 2-التأكيد على الجهود المبذولة لفهم تأثير الحجمية على صحة الإنسان حاليا تحديد الميكروبات المرتبطة بالمكونات التشريحية المحددة (أي، الجلد، الأمعاء، عن طريق الفم، إلخ)، فضلا عن مواقع محلية داخل هذه المقصورات3،4. التي تدعم هذه الجهود التحقيق هو الظهور السريع، وزيادة إمكانية الحصول على تكنولوجيات الجيل التالي التسلسل (خ ع) التي توفر منصة موازية على نطاق واسع لتحليل محتوى الجينية الميكروبية (ميكروبيومي) من عينة. للعديد من عينات الفسيولوجية، ميكروبيومي المرتبطة بها على حد سواء معقدة ووفرة (أيالبراز)، ولكن لبعض العينات، ممثلة في ميكروبيومي بانخفاض الكتلة الحيوية الميكروبية (أي، واللبن البشري، والجهاز التنفسي السفلي) حيث حساسية والتحف الفنية التجريبية، والتلوث المحتمل تصبح القضايا الرئيسية. التحديات المشتركة في الدراسات ميكروبيومي والتصميم التجريبي المناسب قد خضعت متعددة استعراض المواد5،6،،من78.
المقدمة في هذه الوثيقة هو خط أنابيب تجريبية قوية خ ع استناداً إلى المستهدفة تسلسل الرنا الريباسي 16S V4 المنطقة9 تميز ميكروبيومي اللبن البشري. التحليل ميكروبيومي اللبن البشري معقدة ليس فقط طبيعتها منخفضة الكتلة الحيوية الميكروبية10، بل بالإضافة إلى ذلك بارتفاع مستويات الحمض النووي البشري الخلفية11،12،،من1314 و احتمال ترحيل PCR مثبطات15،16 في الحمض النووي المستخرج. يعتمد هذا البروتوكول على مجموعات استخراج المتاحة تجارياً ومنصات شبه الآلية التي يمكن أن تساعد في تقليل التغير عبر نموذج إعداد دفعات. ويضم مجتمع صورية بكتيرية المعالم التي يتم معالجتها جنبا إلى جنب مع عينات كعنصر تحكم الجودة للتحقق من صحة كل خطوة في البروتوكول، وتوفير مقياس مستقل من متانة الأنابيب. ورغم أن البروتوكول كوصف محدد لعينات اللبن البشري، وهو القابلة للتكييف وفقا لأنواع العينة الأخرى بما في ذلك البراز، المستقيم، المهبل، والجلد، ومسحات أريولار، وعن طريق الفم10،17، ويمكن أن تكون بمثابة نقطة انطلاق الباحثين الذين يرغبون في إجراء تحليلات ميكروبيومي.

<table><tbody><tr><td>AllPrep RNA / DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td>طقم استخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي</td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Fisher Scientific</td><td>435532</td><td>RNase و DNase ومزيل الحمض النووي</td></tr><tr><td>خلاط حراري</td><td>فيشر دوامة علمية</td><td></td><td>يتم التحكم في درجة حرارتها</td></tr><tr><td>Buffer RLT plus</td><td>Qiagen</td><td>1053393</td><td>عازلة تحلل ثيوسيانات جوانيدينيوم / جزء من مجموعة</td></tr> <tr><td>Allprep&szlig;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td> <td>& szlig ؛ -ME هو عامل اختزال من شأنه أن يفسد طبيعة RNases بشكل لا رجعة فيه عن طريق تقليل روابط ثاني كبريتيد</td></tr><tr><td>LME Beads</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914050</td><td>أنبوب الخرزة</td></tr><tr><td>QIAgen TissueLyzer</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>مجموعة محول تعطيل العينة الآلي</td></tr><tr><td>QIAshredder العمود</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>أنبوب</td><td>الطرد المركزي الصغير لمصنع</td>أنبوب <td></td><td></td> QIAgen RB في مجموعة</tr><tr><td>QIAcube والأدوات البلاستيكية ذات الصلة</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td>أداة تنقية الحمض النووي / الحمض النووي الريبي الآلي</td></tr><tr><td>مخرج الحمض النووي بالإضافة إلى</td><td>حل إزالة التلوث غير الأنزيمي</td><td>Applichem</td><td>A7089</td></tr><tr><td>EB Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>المخزن المؤقت للشطف</td></tr><tr><td>QIAgility والأواني</td> <td>البلاستيكية ذات الصلةQiagen</td><td>9001532</td><td>معالج السوائل الروبوتية</td></tr><tr><td>PCR المياه</td><td>MO BIO</td><td>17000-5PRIME</td><td></td></tr> <tr><td>HotMasterMix</td><td>Quantabio</td><td>2200400</td><td></td></tr><tr><td>بادئات عكسية مشفرة</td><td>Eurofin</td><td>No Catalog # تم</td><td>تصميمها وطلبها</td></tr><tr><td>96 بئر لوحة PCR</td><td>بالولايات المتحدة الأمريكية العلمية</td><td>1402-9708</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2200 والأواني</td> <td>البلاستيكية ذات الصلةAgilent</td><td>G2964AA</td><td>محلل شظايا الحمض النووي / الحمض النووي الريبي الآلي</td></tr><tr><td>D1000 الكواشف ل Tapestation</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>المخزن المؤقت للعينة والسلم جزء من هذه المجموعة</td></tr> يتم إجراء <tr><td>مجموعة إزالة مثبطات PCR OneStep</td><td>Zymo Research</td><td>50444470</td><td>إزالة مثبطات PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.</td></tr><tr><td>طقم تنقية QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>طقم تنظيف الحمض النووي: تنقية منتجات PCR القائمة على غشاء السيليكا</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32854</td><td>المخزن المؤقت والصبغة القائم على ثنائي ميثيل سلفوكسيد هي جزء من هذه المجموعة.</td></tr><tr><td>كيوبيت فلورومتر</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>مقياس الطيف الضوئي للحجم الصغير</td></tr><tr><td>MiSeq 300 V2 kit</td><td>Illumina</td><td>15033624 / 15033626</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>No Catalog #</td> من <td>الجيل</td></tr></tbody></table> التالي

أسلوب لتسلسل 16s المستهدفة من عينات اللبن البشري

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

وقد أصبحت دراسات المجتمعات الميكروبية على نطاق واسع مع وضع تسلسل غير مكلفة نسبيا والسريع، وارتفاع الإنتاجية. ومع ذلك، كما هو الحال مع جميع هذه التكنولوجيات، تعتمد النتائج استنساخه على سير عمل مختبر الذي يشتمل على الاحتياطات اللازمة والضوابط. وهذا أهمية خاصة مع العينات منخفضة-الكتلة الحيوية حيث تلويث الحمض النووي البكتيري يمكن أن تولد نتائج مضللة. هذه المادة تفاصيل سير شبه الآلي التعرف على الميكروبات من عينات حليب الثدي البشري استخدام تسلسل المستهدفة من منطقة V4 الريباسي الحمض النووي الريبي (الرنا الريباسي) 16S على نطاق throughput منخفضة إلى متوسطة. وصف البروتوكول إعداد عينة من الحليب الكامل الدسم بما في ذلك: عينة تحلل، واستخراج الحمض النووي، والتضخيم من منطقة V4 16S الرنا الريباسي الجينات، وإعداد مكتبة بتدابير مراقبة الجودة. الأهم من ذلك، البروتوكول والمناقشة النظر في القضايا التي البارزة في إعداد وتحليل العينات منخفضة-الكتلة الحيوية بما في ذلك الضوابط المناسبة الإيجابية والسلبية، وإزالة المانع بكر، تلوث العينة بالبيئية، الكاشف، أو مصادر تجريبية، وأفضل الممارسات التجريبية الرامية إلى ضمان إمكانية تكرار نتائج. حين البروتوكول كما هو موضح محددة لعينات اللبن البشري، أنها قابلة للتكيف للعديد من أنواع عينة الكتلة الأحيائية المنخفضة والعالية، بما في ذلك عينات جمعت في مسحات، مجمدة نظيفة، أو استقر في المخزن مؤقت الحفاظ على.

ويشمل البروتوكول المعروضة هنا خطوات مهمة مراقبة الجودة (مراقبة الجودة) لضمان أن تجتمع البيانات التي تم إنشاؤها بالنقاط المرجعية لبروتوكول التحكم حساسية وخصوصية، والتلوث. يتبع الأول QC خطوة البروتوكول [بكر] تضخيم المنطقة V4 16S (الشكل 2). ميليلتر واحد من المنتج بكر من كل عينة تم تحليلها بواسطة التفريد لتأكيد أنه من ضمن نطاق الحجم المتوقع من 315-450 bp (الشكل 2، سهم أحمر). بعض عينات اللبن البشري تولد كميات أقل من منتج معين (<strong...

ويرد سير شبه الآلي لتسلسل الرنا الريباسي 16S من اللبن البشري وأنواع العينة منخفض-الكتلة الأحيائية الأخرى المستهدفة.

أسلوب لتسلسل 16S المستهدفة من عينات اللبن البشري

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

الهدف العام من هذه الطريقة هو تضخيم 16 SRRNA من حليب الأم وعينات أخرى منخفضة الكتلة الحيوية باستخدام بروتوكول شبه آلي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في تطور واضطرابات الميكروبيوم البشري من حيث صلتها بالصحة والمرض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها شبه آلية ، وسهلة الأداء نسبيا ، وقابلة للتكيف مع أنواع العينات المتعددة بما في ذلك الإفراز والمسحات والبراز.بعد إذابة الحليب كامل الدسم وتحويله وفقا لبروتوكول النص ، قم بتدوير العينات عند 5000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق لحبيبات الخلايا. استخدم ملعقة بلاستيكية أو طرف ماصة كبير لإزالة الطبقة الدهنية العلوية. ثم دون إزعاج الحبيبات ، قم بإزالة كل المادة الطافية ، باستثناء 100 ميكرولتر.باستخدام مليلتر واحد من PBS ، أعد تعليق الحبيبات واغسلها. ثم قم بإعداد عنصر تحكم سلبي عن طريق إضافة مليلتر واحد من PBS المعقم إلى أنبوب سعة خمسة ملليلتر. انقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي نظيف بسعة خمسة ملليلتر وقم بتدويره عند 5000 مرة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.ثم استخدم طرف ماصة معقمة مصفاة سعة 1000 ميكرولتر للتخلص من الطبقة الدهنية المطفية بالكامل. لتعطيل العينة وتجانسها ، أضف 600 ميكرولتر من محلول التحلل المحتوي على بيتا ميركابتو إيثانول إلى الحبيبات وانقل المعلق إلى أنبوب خرزة. قم بإعداد عنصر تحكم إيجابي واحد باستخدام عازلة التحلل و 20 ميكرولتر من العينة الوهمية البكتيرية.دوامة جميع أنابيب الخرزة بقوة لمدة 15 ثانية. ثم قم بتسخين العينات على دوامة يتم التحكم في درجة حرارتها عند 37 درجة مئوية و 700 إلى 800 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. قم بتحميل الأنابيب في مجموعة محول تعطيل العينة الآلي.ثم تغلبت الخرزة على العينات عند 30 هرتز لمدة دقيقة واحدة. قم بتفكيك مجموعة المحول وتبديلها يدويا باستخدام لوحات العينة من الذراع الآلي الأيسر إلى الذراع الروبوتية اليمنى للأداة. تغلبت الخرزة على الأنابيب عند 30 هرتز لمدة دقيقة أخرى ثم قامت بالطرد المركزي للأنابيب عند 17 و 200 مرة جم و 25 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق.باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ، قم بإزالة كل المادة الطافية ، مع الحرص على عدم أخذ أي من الطبقة الدهنية في الأعلى أو بقايا الخرز في الجزء السفلي من العينة. ضع المادة الطافية على أعمدة الخالط. ثم قم بالطرد المركزي للأعمدة بأقصى سرعة و 25 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق.انقل 350 ميكرولتر من eluid إلى أنبوب طرد مركزي دقيق من مصنعي ملليلتر. لعزل الحمض النووي وفقا لبروتوكول النص ، قم بقطع الأغطية وتنعيم حواف أعمدة الدوران الفردية للحمض النووي والحمض النووي الريبي. أدخل عمود دوران الحمض النووي بدون أنبوب التجميع في محول الدوار.ثم تخلص من أنبوب التجميع. بعد ذلك ، أدخل أنبوبين مليلترين دواميين في شاكر ، باتباع مخطط تحميل أداة تنقية الحمض النووي / الحمض النووي الريبي الآلي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتسمية أنابيب تجميع خمسة ملليلتر من نقطة واحدة وإدخالها في محولات الدوار.ثم اضبط محولات الدوار في جهاز الطرد المركزي باتباع مخطط تحميل أداة تنقية الحمض النووي / الحمض النووي الريبي الآلي. بعد إدخال أطراف المرشح ، والماء الخالي من RNase ، والكواشف في كتلة كاشف الجهاز ، أغلق غطاء الأداة وقم بتشغيل برنامج تنقية الحمض النووي المخصص على الجهاز. عند اكتمال التفاعل ، اجمع العينة التي تحتوي على أنابيب من شاكر ، وإذا تركت أي عينة ، فقم بتخزينها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر للتخزين على المدى القصير أو 80 درجة مئوية تحت الصفر للتخزين طويل الأجل.بعد تحضير منطقة العمل ، والمزيج الرئيسي ل PCR ، وفقا لبروتوكول النص ، قم بتحميل 50 إلى 100 ميكرولتر من عينات الحمض النووي في محول عينة أداة مكون من 32 بئرا ، باتباع خريطة اللوحة المكونة من 96 بئرا. لكل لوحة PCR ، قم بإعداد عنصرين من عناصر التحكم السلبية عن طريق سحب 30 ميكرولترا من ماء PCR في أنبوب تجميع نظيف بنقطة واحدة وخمسة ملليلتر. ثم ضع جميع العينات على محول عينة الأداة المكون من 32 بئرا مع أغطية مقفلة في الوضع المفتوح.في محول كاشف الجهاز ، قم بإزالة غطاء كل برايمر عكسي بأرقام رمز شريطي محددة واحدا تلو الآخر. لتحميل معالج السائل الآلي ، ضع محول الكاشف في موضعه B1.In الترتيب لتجنب تأثير الحافة ، ضع إحدى حواف المحول بعناية على جانب المقبض وقم بإزالة الحافة الأخرى ببطء. تأكد من الضغط على جميع زوايا المحولات.ضع محول العينة في الموضع C1 ، مع التأكد من الضغط على جميع زوايا المحولات. ثم دوامة مزيج رئيسي سعة خمسة ملليلتر. افتح الغطاء وضعه في الموضع A على المزيج الرئيسي للأداة وكتلة الكاشف.ضع لوحة PCR على محول الجهاز المكون من 96 بئرا والذي يهدف إلى حمل لوحات PCR نصف حواف. ثم ابدأ التشغيل واحفظه كملف جديد. عند اكتمال التشغيل، تحقق من عدم وجود أخطاء.ثم استخدم 12 أو ثمانية أغطية شريطية لإغلاق اللوحة. دوامة بقوة واستخدم لوحة دوارة 96 بئرا لتدوير الألواح لمدة دقيقة واحدة. أخيرا ، ضع اللوحة على الجليد حتى يتم نقلها إلى غرفة التضخيم اللاحقة وتحميلها على الدراجة الحرارية.بعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإجراء مراقبة الجودة وإعداد المكتبة وفقا لبروتوكول النص. تتبع خطوة مراقبة الجودة الأولى للبروتوكول تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لمنطقة 16SV4. كما هو موضح هنا ، تم تحليل ميكرولتر واحد من منتج PCR من كل عينة عن طريق الرحلان الكهربائي للتأكد من أنه كان ضمن نطاق الحجم المتوقع من 350 إلى 450 زوجا أساسيا.أنتجت بعض عينات الحليب البشري كميات أقل من منتج معين ، مما يشير إما إلى مستويات منخفضة من الحمض النووي الميكروبي المستخرج في تلك العينات أو ترحيل مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل أثناء الاستخراج. كان القياس الكمي لمنتج معين لكل عينة ضروريا لتحديد حجمه المطلوب للتجميع المولي المتساوي للعينات للتسلسل. عادة ما يهيمن منتج PCR معين على المكتبة المجمعة للتسلسل المستهدف.إذا كان هناك قدر كبير من المنتجات غير المحددة في المكتبة ، فيجب إضافة خطوة تنقية الهلام إلى سير العمل. تظهر نتائج التسلسل تنوعا عاليا في الأصناف المرتبطة بميكروبيوم حليب الأم والتباين في عدد أعداد القصب المتتسلسل لكل عينة. في المقابل ، كانت تركيبة الأصناف وعدد القصب للمحاكاة البكتيرية قابلة للمقارنة مع النتائج التي تم الحصول عليها للوهمية في عمليات سير العمل السابقة ، مما يشير إلى أن التباين الملحوظ لعينات الحليب البشري هو نتيجة تجريبية أصلية وليست دالة لتباين سير العمل الجوهري.في حالة ترك جهاز التسلسل قيد التشغيل طوال الليل ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون يومين ، من 12 إلى 24 عينة ، إذا تم تضخيم جميع العينات في تشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل الأولي. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فستكون هناك حاجة إلى يوم آخر من الصدفة. عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم السفر فقط من منطقة ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى منطقة ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل لتجنب التلوث.من الأهمية بمكان أيضا تغيير القفازات بشكل متكرر لتجنب أي تلوث متبادل. لا تنس أن العمل مع العينات البشرية يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما استخدام الاحتياطات ، مثل معدات الحماية المناسبة وخزانات السلامة الحيوية.

a-method-for-targeted-16s-sequencing-of-human-milk-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

كان توصيف المجتمع الميكروبي هدفا طويل الأمد في علم الأحياء الدقيقة البيئي. تسمح طرق تسلسل الجيل التالي الآن بتوصيف المجتمعات الميكروبية على عمق غير مسبوق بأقل تكلفة وعمالة. نوضح هنا بالتفصيل نهجنا لتسلسل جينات الحمض النووي الريبي الريبوسومي البكتيرية 16S باستخدام جهاز التسلسل على الطاولة.

الجيل المقبل من تسلسل خاص بالريبوسوم 16S RNA جين Amplicons

باستخدام التليف الكيسي الهوائية كمثال على ذلك، تقدم المخطوطة سير عمل شامل يضم مجموعة من النهج ميتاجينومية وmetatranscriptomic لتوصيف الجرثومية والفيروسية المجتمعات في عينات المرتبط الحيوان.

تنقية انجاس: تسلسل Metagenomes وMetatranscriptomes من مجمع عينات المرتبط الحيوانية

وصفنا وسيلة فعالة وقوية، وفعالة من حيث التكلفة لاستخراج الحمض النووي من مسحات لتوصيف المجتمعات البكتيرية باستخدام 16S الريباسي amplicon الجينات التسلسل. يسمح طريقة لنهج المعالجة المشترك لأنواع عينة متعددة ويستوعب عددا من العمليات التحليلية المصب.

كفاءة نوكليك حمض استخراج و16S الريباسي جين تسلسل للبكتيريا الجماعة توصيف

ويصف هذه المخطوطة بروتوكول موحد مفصلة لتسلسل الرنا الريباسي amplicon الفائق 16S. ويدخل البروتوكول بروتوكولا المتكاملة ويرتدون الزي العسكري ومجدية وغير مكلفة بدءاً من جمع عينات البراز من خلال تحليل البيانات. ويتيح هذا البروتوكول تحليل عدد كبير من العينات مع المعايير الصارمة والعديد من عناصر التحكم.

بروتوكول المصحوبة بمرشدين لتوصيف الجراثيم البراز بتسلسل الرنا الريباسي-Amplicon 16S

يصف لنا هنا كشف الفائق والتقدير الكمي فوكوسيلاتيد لبن oligosaccharides (إهمال) استخدام بيوسينسور كامل الخلية. كما نبدي هنا، تكييف هذا البرنامج نحو تحليل لسلالات إنتاج مؤمن، مع التركيز على تحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء.

تحليل تريساكتشاريديس الحليب فوكوسيلاتيد الإنسان في سياق التكنولوجيا الأحيائية باستخدام جينياً ترميز أجهزة استشعار العوامل البيولوجية

وصف هنا هو اجراء التشغيل القياسية مبسطه لتشكيل الميكروبيوم باستخدام 16s rrna metagenomic التسلسل والتحليل باستخدام الاداات المتاحة بحريه. هذا البروتوكول سوف تساعد الباحثين الذين هم جديده في مجال الميكروبيوم وكذلك تلك التي تتطلب تحديثات علي أساليب لتحقيق التنميط البكتيرية في دقه اعلي.

تحليل الكائنات المجهرية باستخدام ثنائي الخطوة PCR والجيل التالي من 16S rRNA التسلسل الجيني

وينقل حليب الثدي فيروس نقص المناعة البشرية، على الرغم من أن حوالي 15 في المائة فقط من الرضع الذين يرضعون رضاعة طبيعية من الأمهات المصابات بفيروس نقص المناعة البشرية يصابون بالعدوى. الرضع الذين يرضعون رضاعة طبيعية تناول ~ 105−108 الكريات البيض الأمومية يوميا، على الرغم من أن هذه الخلايا هي أقل دراسة. هنا نقوم بوصف عزل ة حليب الثدي الكريات البيض وتحليل قدرتها الفصوتية.

عزل الكريات البيض عن حليب الثدي البشري للاستخدام في فحص الفيغوسية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة لأهداف فيروس نقص المناعة البشرية

توضح هذه المقالة كيفية تجميع جهاز يمكن استخدامه لجمع الحليب من فئران المختبر. هذا الجهاز ميسور التكلفة ومحمول ويسمح بجمع 0.1-0.5 مل من الحليب بواسطة شخص مدرب واحد. يتم أيضا تضمين بروتوكول حلب مفصل.

تقنية فعالة لشخص واحد لأخذ عينات الحليب من فئران المختبر

تصف المقالة بروتوكولا لإعادة تكوين ميكروبيوتا الحليب المبستر المتبرع باستخدام ميكروبيوتا حليب الأم في بيئات عملية في العالم الحقيقي. إنه يوضح النمو البكتيري الفعال وتعديل الميكروبيوم ، مما يدعم التطبيق العملي لهذا الإجراء في الرعاية الروتينية لمستشفى الولادة وبنك الحليب البشري المرتبط به.

إعادة التكوين الفردية لميكروبات الحليب البشري: نهج ممكن في بيئات العالم الحقيقي

تم تصميم هذا البروتوكول لتسريع والسماح بالعزل الفعال للحويصلات خارج الخلية من حليب الثدي البشري ذو النقاء العالي.

العزل السريع للحويصلات خارج الخلية المشتقة من حليب الثدي البشري

يتيح هذا البروتوكول تقييما سريعا وفعالا من حيث التكلفة للتركيب الميكروبي في منتجات الألبان من خلال الجمع بين الثقافات ومرض التصلب العصبي المتعدد. إنه يقدم نتائج تصنيف مماثلة لتسلسل 16S rRNA مع وقت استجابة أقصر من طرق الثقافة التقليدية.

تقييم السلامة الميكروبية لمصانع الألبان باستخدام التنميط البروتيني البكتيري عبر نهج MALDI

تعلم تسلسل 16S المستهدف من عينات اللبن البشري منخفضة الكتلة الحيوية باستخدام بروتوكول شبه آلي. يُبسط هذا الأسلوب تحليل الميكروبيوم ويساعد الباحثين على دراسة دوره في الصحة والمرض.

أسلوب لتسلسل 16S المستهدفة من عينات اللبن البشري

استكشف المزيد من الفيديوهات