قياس متزامنة من بيروكسيد الهيدروجين فائق أكسيد/وإنتاج NADH Dehydrogenases المتقدرية المحتوية على فلافين

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد معدل إنتاج الأكسيد الفائق / بيروكسيد الهيدروجين و NADH لنازعة هيدروجين الميتوكوندريا المنقاة المحتوية على الفلافين باستخدام قياس الفلور المجهري. يمكن أن تحتوي الميتروندريا على ما يصل إلى 12 موقعا مختلفا لتكوين بيروكسيد الفائق / بيروكسيد الهيدروجين والتي تم تحديدها باستخدام مجموعات مختلفة من الركيزة والمثبطات مع الميتوكوندريا المعزولة. ومع ذلك، لا تزال هناك بعض الصعوبات فيما يتعلق بالقياس الدقيق لقدرة إطلاق مواقع الإنتاج الفردية في الميتوكوندريا المعزولة.

وهذا يرتبط بتفاعلات جانبية غير مرغوب فيها تنتج أيضا أنواع الأكسجين التفاعلية ، ولكن أيضا وجود مضادات الأكسدة واستخدام مثبطات تفتقر إلى الخصوصية بالإضافة إلى استخدام المواد المضافة التي يمكن أن تتداخل مع القياسات. نقدم هنا طريقة القياس المتزامن لإنتاج بيروكسيد الفائق / بيروكسيد الهيدروجين و NADH عن طريق نازعة هيدروجين الميتوكوندريا المنقاة المعتمدة على الفلافين. هذه الطريقة مفيدة لأنها يمكن أن تسمح بالقياس الكمي المباشر والدقيق لإمكانات إنتاج ROS لمواقع الإنتاج الفردية عن طريق القضاء على التفاعلات الجانبية غير المرغوب فيها وأي أنظمة تبريد تفاعلية لأنواع الأكسجين.

المقياس المتزامن لكل من إنتاج ROS و NADH أيضا بالمقارنة المباشرة بين إمكانات تكوين بيروكسيد الهيدروجين الفائق / الهيدروجين ونشاط الإنزيمات الفردية التي يمكن أن تكون ذات قيمة لفحص مثبطات إنتاج ROS قبل إجراء المقايسات مع الميتوكوندريا. لأغراضنا هنا ، سنستخدم مركب نازعة هيدروجين البيروفات ومركب نازعة هيدروجين ألفا كيتوجلوتارات من أصل قلب الخنازير كأمثلة. كلاهما إنزيمات تحتوي على الفلافين ومصادر معروفة لأنواع الأكسجين التفاعلية.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تنقية هذين الإنزيمين بسهولة. يتم تحقيق القياس المتزامن لبيروكسيد السوبر / بيروكسيد الهيدروجين و NADH من خلال تتبع التغيرات في الإزهار. NADH لها خصائص الإزهار الجوهرية الخاصة بها والتي تسمح بقياس إنتاجها بسهولة.

وفي الوقت نفسه ، تتطلب التغييرات في بيروكسيد الهيدروجين الفائق أكسيد ديسموتاز, بيروكسيداز الفجل الحار وكاشف أمبلكس فائق الأحمر. في وجود بيروكسيداز الفجل وبيروكسيد الهيدروجين ، يتم تحويل أمبليكس ألتراريد من جزيء غير فلوري إلى ريسورفين الفلورسنت. يضمن ديسموتاز الأكسيد الفائق تحويل أي أكسيد فائق يتكون من نازعة الهيدروجين قيد الدراسة إلى بيروكسيد الهيدروجين.

قبل إعداد الفحص ، يتم إعداد حلول العمل. لتبسيط الفحص ، تتم إضافة جميع الكواشف إلى آبار صفيحة سوداء مكونة من 96 بئرا في حصص 20 ميكرولتر. حجم كل تفاعل في البئر هو 200 ميكرولتر ، وبالتالي فإن محاليل العمل هي 10 أضعاف التركيز الموجود في بئر التفاعل.

بعد ذلك ، قم ببرمجة قارئ الصفيحة الدقيقة لإجراء اختبار حركي للقياس المزدوج للإزهار الذاتي NADH والإزهار الريسوفين. يتم ذلك عن طريق تحديد الإجراء أولا وضبطه على 25 درجة مئوية. بعد ذلك ، انقر فوق بدء الحركة.

اضبط الوقت للتشغيل لمدة خمس دقائق تقريبا متبوعا باختيار فاصل قراءة فلورسنت يبلغ 30 ثانية. بعد ذلك ، انقر فوق قراءة وقم بتعيين معلمات قياس الفلورسنت للمقايسة الخاصة بك. هنا يتم إدخال موضع المسبار والأطوال الموجية المستخدمة لتتبع التغيرات في الإزهار والآبار التي ستتم قراءتها في البرنامج.

يتم أيضا تحديد القنوات المختلفة لقراءات الفلورسنت مع إحداها المخصصة للإزهار الذاتي ل NADH ، والتي تم ضبطها على 376 نانومتر من الإثارة وأطوال موجية انبعاث 450 نانومتر. يتم تتبع التغييرات في إزهار الريسوروفين عند 565 نانومتر و 600 نانومتر. بمجرد إعداد شروط الفحص ، يتم تحميل الآبار الفردية بمخزن مؤقت وكواشف مختلفة مطلوبة لقياس كل من NADH وإنتاج بيروكسيد الهيدروجين الفائق / الهيدروجين في نفس الوقت.

ترتيب تحميل الآبار بكواشف مختلفة هو كما يلي. أولا ، تضاف الكمية المطلوبة من المخزن المؤقت إلى البئر متبوعا بإضافة 20 ميكرولترا من محلول الإنزيم المنقى. يتم توازن الإنزيم في المخزن المؤقت لبضع دقائق داخل الأداة.

وبعد ذلك ، تتم إضافة الكواشف المتبقية بالترتيب التالي. بمجرد إضافة الركيزة ، اضغط على ابدأ. سيدخل حامل اللوحة إلى القارئ وسيتم بدء البروتوكول.

أثناء الفحص ، يمكن تتبع المخرجات في الوقت الفعلي لوحدات الفلورسنت النسبية الخام ، أو RFUs ، باستخدام البرنامج. يمكن للمستخدم التنقل بين قراءات الفلورسنت المختلفة باستخدام علامة التبويب "البيانات" أعلى تخطيط البئر. لاحظ أنه يمكن تحديد منحنيات قراءات الفلورسنت المختلفة.

بالإضافة إلى ذلك ، من خلال الضغط على Control على لوحة المفاتيح والنقر بزر الماوس الأيسر على الآبار ، يمكن للمرء أن ينتج رسما بيانيا مركبا يسمح بإجراء مقارنات في الوقت الفعلي للتفاعلات المختلفة. عند الانتهاء من التجربة ، سيخرج حامل الصفيحة الدقيقة من الأداة. في هذه المرحلة، يتم تصدير النتائج الموجودة في الرسم البياني التمثيلي للتغييرات في RFU إلى Excel.

يتم تصدير قيم RFU الأولية بالنقر أولا على البيانات الموجودة على الرسم البياني RFU التمثيلي. سينتج عن هذا جدول بقيم RFU الأولية ل NADH و resorufin الإزهار. لا يعني ذلك أن أرقام RFU الخام المقابلة للتغيرات في NADH أو إزهار resorufin لا يمكن تصديرها في وقت واحد.

بمجرد التصدير، يتم تنظيم النتائج للتحليل. باستخدام المنحنيات القياسية ل NADH وإزهار الريسوروفين المتولدة قبل إجراء الفحص ، يمكن حساب كمية NADH في الميكرومول وبيروكسيد الفائق / بيروكسيد الهيدروجين في البيكومول المتشكل بمرور الوقت. يمكن أن يتبع ذلك حساب معدل NADH وإنتاج بيروكسيد الفائق / بيروكسيد الهيدروجين.

بالنسبة لهذا الإجراء ، من الضروري التحقق من نقاء نازعة الهيدروجين المعزولة المحتوية على الفلافين قبل إجراء الفحوصات. يمكن تحقيق ذلك عن طريق إجراء صبغة كوماسي بسيطة للبروتينات أو عن طريق فحص نشاط الإنزيم في وجود ركائز مختلفة. لاحظ أنه ينصح بحذف عوامل الاختزال مثل DTT من الفحص لأنها يمكن أن تكون بمثابة ركيزة لإنتاج بيروكسيد الهيدروجين الفائق / الهيدروجين بواسطة نازعة الهيدروجين المرتبطة بالفلافين.

بشكل عام ، هذه الطريقة مرنة للغاية من حيث أنه يمكن استخدامها لفحص مثبطات إنتاج بيروكسيد الفائق / الهيدروجين وتسمح أيضا بإجراء مقارنة مباشرة لقدرة تكوين ROS لنازعة هيدروجين الميتوكوندريا المختلفة المرتبطة بالفلافين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم وثيق لكيفية قياس إنتاج ROS و NADH عن طريق نازعة الهيدروجين المنقاة. يمكن أن يكون هذا الاختبار بمثابة نقطة انطلاق لتجارب أكثر تعقيدا مع الميتوكوندريا المعزولة.