التصور للوحدات القشرية في الأرض كورتيسيس الثدييات

توضح هذه المقالة منهجية مفصلة الحصول على مقاطع عرضية مسطح من الثدييات كورتيسيس ووضع تصور للوحدات القشرية باستخدام histochemical وأساليب المناعي.

الهدف العام لهذا الإجراء لتسطيح القشرة وتلطيخها هو تصور الوحدات الخلوية في المناطق القشرية بطريقة طبقية. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأعصاب ، مثل كيفية انتشار البنية القشرية في الدماغ ، وكيف يمكن أن ترتبط بالوظيفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكنك مقارنة العمارة القشرية بطريقة رقائقية ، ومقارنة الجوانب المختلفة لها ، مثل كيفية الحفاظ على تطور الطبقة ، أو كيف تختلف في الوظيفة.

سيوضح هذه التقنية سايمون لاور وأوندين شنويب ، وهو طالب وفني من مختبر البروفيسور ميشيل بلاك. للبدء ، قم بنشر عبر القلب للحصول على دماغ ثابت وخالي من الدم. بعد إزالة الدماغ ، اغمره في محلول فوسفات 0.1 مولار.

إذا كانت الأقسام ذات المساحات القشرية الكبيرة مطلوبة ، فقم بتسطيح الدماغ قبل مزيد من التثبيت. ومع ذلك ، للحصول على أقسام من المناطق التي يصعب الوصول إليها ، مثل القشرة المخية الداخلية الإنسية ، قم بتثبيت الدماغ في 4٪ PFA لمدة 24 ساعة قبل التسطيح. استعد للحفاظ على رطوبة الدماغ مع المخزن المؤقت أثناء التشريح بأكمله.

للبدء ، افصل نصفي الكرة الأرضية باستخدام مشرط. إذا لم يتم تثبيت الدماغ ، فكن حذرا عند التعامل معه. بعد ذلك ، أثناء تأمين الدماغ بواسطة المخيخ ، أدخل الملعقة برفق لفتح مستوى تشريح في الجسم الثفني.

يجب أن يشير الطرف المستدير للملعقة بعيدا عن القشرة. ثم قم بمعالجة الملعقة لتقسيم المهاد والقشرة. بعد ذلك ، افصل الهياكل تحت القشرية باستخدام شفرة حلاقة.

بعد ذلك ، افصل الهياكل تحت القشرية باستخدام مشرط أو حافة ملعقة. لتحسين التسطيح ، قم بعمل قطع نظيف من خلال المخطط ، والنواة المتكئة ، والقشرة الأمامية المدارية ، لأنها تزيد من سمك القشرة في المنطقة الجانبية. ثم أضف قطعا مخففا في قاعدة المنطقة الداخلية لقشرة الفص الجبهي.

سيسمح ذلك بالكشف عن الأجزاء الإنسية من القشرة. الآن ، ضع قشرة نصف الكرة الأرضية لأسفل على شريحة زجاجية. ثم ضع أسطوانتين من الطين على جانبي الأنسجة.

يجب أن يكون الطين أرق بنسبة 10 إلى 20٪ من أنسجة المخ ، حيث يحدد الطين مدى التسطيح. بعد ذلك ، ضع جانبا زجاجيا عرضيا على القشرة ، مع الاتصال بالجزء الجانبي أولا. ثم ضع وزنا على الزجاج ، مع توسيط الكتلة فوق الجزء الجانبي.

الآن ، دع المجموعة تجلس لمدة ثلاث إلى خمس ساعات في مخزن الفوسفات عند أربع درجات مئوية. المفتاح الحقيقي لهذا التحضير هو جعل الدماغ مسطحا قدر الإمكان ، لأن هذا له أكبر تأثير على عرض الخريطة القشرية. أخيرا ، إذا لزم الأمر ، قم بإصلاح الدماغ.

انقل نصف الكرة الأرضية المسطح إلى 1٪ PFA ، أو 2٪ PFA إذا لم يتم أخذه من منفوخ. ثم اتركه لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية ، مع تحريك لطيف. أولا ، اغسل نصف الكرة الأرضية المسطح في عازلة الفوسفات لمدة 15 دقيقة.

ثم قم بتقطيع نصف الكرة الأرضية بشكل عرضي على الاهتزاز. ثبت الأنسجة في موضعها باستخدام كمية صغيرة من السيانواكريلات والضغط اللطيف. كن حذرا ، لأن الكثير من الغراء يمكن أن يؤدي إلى قطع القطع الأثرية.

الآن ، قم بقص نصف الكرة الأرضية من الطرف الأكثر سمكا والأكثر استقرارا باتجاه الطرف الرقيق بالسمك المطلوب. إذا تم استخدام تركيزات مثبتة منخفضة ، فقم بقطع الأنسجة ببطء بسعة عالية. بعد ذلك ، اغسل الأنسجة المقطعة في عازلة هيبس لمدة 15 دقيقة بتحريض لطيف.

أثناء الغسيل ، قم بإعداد محلول تلطيخ سيتوكروم أوكسيديز الطازج. وأضف مكون DAB قبل استخدامه مباشرة. الآن ، احتضن الأقسام في محلول التلوين الطازج في درجة حرارة الغرفة باستخدام شاكر وراقب.

اعتمادا على مقدار التثبيت ، يمكن ملاحظة التلوين في غضون 10 دقائق أو يستغرق الأمر عدة ساعات. إذا كان التفاعل يسير ببطء شديد ، فقم بزيادة درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. لإيقاف رد الفعل ، انقل الأقسام إلى حمام بنسبة 4٪ PFA واتركها تحتضن لمدة 15 دقيقة مع تحريك لطيف.

ثم اغسل الأقسام ثلاث مرات باستخدام عازلة الهيبيس لمدة 10 دقائق لكل غسلة. الآن ، قم بتركيب وتجفيف الأقسام على شرائح زجاجية. وقم بتجفيفها باستخدام حمامات الإيثانول الأقوى تدريجيا.

بعد ذلك ، اغسل الشرائح في الأيزوبروبانول لمدة خمس دقائق ، متبوعا بالزيلين لمدة خمس دقائق. بعد حمام الزيلين ، أضف على الفور وسيط تثبيت سريع التصلب وغير قائم على الماء. الوسائط المائية سوف تحلل البقعة.

بعد إضافة قسيمة الغطاء ، قم بتخزين الشرائح عند أربع درجات مئوية حتى يتم تصويرها. تمت معالجة الأجزاء القشرية من القشرة الحسية الجسدية في مجموعة متنوعة من الدماغ ، باستخدام الإجراءات الموصوفة. يسمح هذا النهج المقارن بدراسة القوى التطورية التي تشكل القشرة ، مثل التمثيل المحفوظ للغاية للاهتزاز المتمزق في القوارض و lagomorpha كبراميل.

لوحظت بنية القشرة المخية الداخلية الإنسية أقساما موازية لسطح التقشير ، باستخدام التقسيم العرضي للقشرة الداخلية الطبية في الفئران والجرذان وخفافيش الفاكهة المصرية. بالإضافة إلى ذلك ، تمت معالجة الأدمغة البشرية باستخدام تسطيح لطيف للقشرة والشرائح العرضية. تم حفظ جميع الأدمغة بالتبريد ، وتم تقسيمها على ناظم البرد عند 60 ميكرون.

تم استخدام التلوين المناعي لتسمية وحدات الخلايا المجاورة للأوعية بالكالبيندين. في القشرة الداخلية ، تظهر وحدات الكالبيندين دورية ملحوظة في كل نوع ، وتختلف في الحجم بمعامل 10 فقط ، عبر تباين 20،000 ضعف في حجم الدماغ. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على أقسام عرضية للتحليل.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون ساعتين. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تسطيح الدماغ بشكل صحيح ، بدلا من الحجم أو الجودة أو النتائج النهائية. لا تنس أن العمل مع وكلاء مثل PFA و DAB يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب عليك دائما ارتداء ملابس واقية والعمل تحت ضوء الميدان.