الثقافات الخلية الأولية من ظهارة صباغ الشبكية الماوس

ظهارة صباغ الشبكية (RPE) ظهارة متعدد الوظائف للعين. نقدم هنا بروتوكولا لإنشاء الثقافات الخلية الأولية المستمدة من RPE مورين.

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار طريقة مجدية للحصول على خلايا ظهارة صبغية الشبكية من عيون الفئران ، وزراعتها في المختبر مع الاحتفاظ بخصائصها الأصلية. ستساعد هذه الطريقة باحثي RPE على اكتساب مهارات التشريح المطلوبة لإنشاء مزارع خلايا RPE للفئران ، وتوضيح كيفية القيام بذلك بطريقة سهلة. الميزة الرئيسية لهذا الإجراء هي أنه بسيط وممكن.

الشيء الوحيد المطلوب هو الممارسة ، ويوضح العرض المرئي لعزل RPE والفحص المجهري حرفيا كيفية الحصول على المهارات المطلوبة. لعزل مقل عيون الفأر ، قم أولا بالقتل الرحيم لفأرين باستخدام أي طريقة معتمدة ، وارتداء القفازات ضعها على وسادة ماصة. ضع إصبع الإبهام والسبابة حول العين وادفع الجلد برفق لانتفاخ مقلة العين.

بمجرد بروز مقلة العين ، دس طرف مقص بزاوية بين الجلد ومقلة العين وقم بقص الأنسجة حول العين بعناية حتى يتم تحريرها. بعد ذلك ، اغمس العين المعزولة لفترة وجيزة في 70٪ من الإيثانول واغمرها في PBS في طبق بتري. بعد جمع كلتا العينين من كل من الفئران ، تابع التشريح.

تحت المجهر التشريح ، قم بإزالة غالبية الأنسجة الضامة بعناية من حول العين. ليس من الضروري إبقاء العين مغمورة خلال هذه الخطوة. للقيام بذلك ، استخدم ملقط الخياطة لرفع الأنسجة الضامة من مقلة العين ، وقم بقصها باستخدام مقص فاناس.

لا تقطع الصلبة لأنه من المستحيل عمليا الحصول على أكواب العين الخلفية السليمة إذا تم قطع الصلبة. بعد تنظيف النسيج الضام ، اغمر مقل العيون في PBS ، وانتقل إلى العمل في خزانة تدفق رقائقي في ظل ظروف معقمة. الآن ، استخدم الملقط لنقل العينين إلى طبق من DMEM الدافئ يحتوي على تركيز عال من الجلوكوز.

بعد 20 إلى 30 ثانية ، استبدل محلول الغسيل باستخدام الشفط لغسل ثان. انقل مقل العيون إلى محلول عمل دافئ بنسبة 2٪ Dissopase II في أنابيب سعة 15 مل واترك العينين تحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة للانفصال. بعد الحضانة ، يجب أن تكون مقل العيون ناعمة.

بعد ذلك ، اغسل العينين مرتين في نفس الوعاء بوسط نمو دافئ. بعد الغسيل الثاني ، استبدل وسط النمو بوسط طازج ، وانقل مقل العيون والوسط إلى طبق جديد لمواصلة التشريح. استمر في العمل على مقعد نظيف بمساعدة مجهر التشريح.

ابدأ التشريح عن طريق تأمين العين بالملقط وقم بعمل شق حول أورا سيراتا باستخدام مقص فاناس. مع الحفاظ على مقلة العين في المحلول ، قم بإزالة القرنية الأمامية بعناية عن طريق تمديد الجرح حول محيط أورا سيراتا. بعد الانتهاء من القطع ، اسحب القرنية الأمامية.

بعد ذلك ، قم بإزالة كبسولة العدسة والظهارة المصطبغة بالقزحية المصاحبة عن طريق سحبها برفق من كوب العين باستخدام ملقط مسنن. ثم كرر التشريح على العيون المتبقية واحتضان أكواب العين الخلفية في وسط النمو لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتسهيل فصل الشبكية العصبية عن RPE. بعد 20 دقيقة ، قطعي أكواب العين الخلفية إلى أربع بتلات.

اجعل الجروح طويلة بما يكفي لتسطيح كوب العين ، ولكنها قصيرة بما يكفي للحفاظ على البتلات متصلة. بعد ذلك ، قم بتسطيح كوب العين لإزالة الشبكية العصبية. قم بتأمين مركب الصلبة المشيمية RPE المتبقي باليد غير المهيمنة واسحب شبكية العين برفق شديد من الحواف.

بمجرد إزالة الشبكية العصبية ، انقل مركب الصلبة المشيمية RPE إلى أرباع إلى طبق ثقافة معقم جديد مليء بوسط النمو الدافئ. في طبق بتري ، قم بتأمين بتلة واحدة من مركب الصلبة المشيمية RPE المقطع إلى أرباع باستخدام ملقط فائق النعومة ، وباستخدام سكين هلال جراحي مجهري ، قم بتقشير صفائح RPE السليمة برفق من الغشاء القاعدي الأساسي. يجب تمييز RPE البني بوضوح عن المشيمية الداكنة واللزجة والرقيقة.

بعد ذلك ، بلل طرف ماصة دقيقة p200 بوسط نمو واستخدم الحافة لنقل أوراق RPE إلى الطبق الجديد الذي يحتوي على وسط نمو دافئ. الآن ، اغسل أوراق RPE ثلاث مرات في وسط نمو دافئ. بعد كل خطوة غسيل، اجمع أوراق RPE بعناية مع تجنب الأنسجة الأخرى، مثل الحطام من شبكية العين أو المشيمية.

بعد الغسيل الأخير ، انقل صفائح RPE إلى أنبوب سعة 1.5 مل ، واتركها تترسب عن طريق الجاذبية. بعد ذلك ، في خزانة التدفق الصفحي ، قم بإزالة وسط النمو الإضافي وأعد تعليق الخلايا في وسط نمو دافئ حديث. الآن ، قم بتقطيع الأنسجة برفق باستخدام ماصة دقيقة p200 دون عمل فقاعات.

ثلاثي بين 40 و 50 مرة ، يكفي فقط لعمل تعليق خلية واحدة. كن حذرا لأن الكثير من التجارب يمكن أن يكون قاتلا. الآن ، قم بوضع خلايا RPE التي تم جمعها من كلا الفئران في غشاء بوليستر واحد سعة 12 مل في بئر صفيحة ثقافة 12 بئر.

مطلوب كثافة خلوية عالية بحيث تحتفظ خلايا RPE بشكلها السداسي وتصبغها. وصلت مزرعة RPE الأولية للفأر التي تم إنشاؤها من فأرين في غشاء بوليستر 12 مم إلى 90 إلى 95٪ من التقاء بعد أسبوع واحد في المزرعة. بعد أسبوعين في الثقافة ، كانت الخلايا ملتقية بنسبة 100٪ وبدأت في تكوين فسيفساء من الخلايا السداسية المصطبغة وثنائية النواة.

بحلول الأسبوع الثالث ، استمرت الخلايا في التغير في الشكل والتصبغ. ومع ذلك ، بعد أربعة أسابيع ، أصبح جزء من الخلايا مفرط التصبغ. تم تقييم نقاء ثقافة خلايا RPE الأولية باستخدام الجسم المضاد RPE65 ، الذي يصنف الريتينويد isomerohydrolase ، وهو إنزيم مهم للدورة البصرية للفقاريات.

تم إثبات سلامة الخلية مع تقاطعات الخلية وشكل الخلية السداسية من خلال تلطيخ الباللويدين. تم تصور التقاطعات الضيقة من خلال تحليل تعبير بروتين ZO-1 ، والذي يمكن تصوره باستخدام صبغة أمينية والتحقق من صحتها عن طريق النشاف الغربي. بشكل عام ، فإن الثقافات قادرة على التكاثر والاحتفاظ بالتصبغ وشكلها السداسي أثناء تشكيل تقاطعات ضيقة والتعبير عن علامات وظيفية ، مثل RPE65.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل خلايا RPE عن عيون الفأر وزراعتها بشكل صحيح في المختبر. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر دائما إبقاء العينين مبللتين ومحاولة العمل بأسرع ما يمكن.