Name: الثقافات الخلية الأولية من ظهارة صباغ الشبكية الماوس (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: تعلم عزل وزراعة خلايا ظهارة صباغ الشبكية من عيون الفئران مع الحفاظ على خصائصها الأصلية. يوفر هذا البروتوكول البسيط والقابل للتطبيق مهارات التشريح اللازمة لإجراء دراسات علم الأعصاب وعلم الأحياء الخلوية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم تمويل هذه الدراسة جزئيا بالمؤسسة برايتفوكوس (إلى DS).

وافقت على "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في جامعة بيتسبرغ الإجراءات التي تنطوي على الموضوعات الحيوان
1. إعداد الحلول
<ol><li>يعد النمو المتوسطة بالمكملين دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دميم)، وارتفاع الجلوكوز مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، 1% البنسلين/ستربتوميسين، 2.5 مم L-الجلوتامين و 1 الأحماض MEM x الأمينية غير الأساسية. قبل الحارة وسائط الإعلام في حاضنة 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.</li>
	<li>إعداد حل العامل الثاني ديسباسي 2 ٪ (wt/المجلد):<ol>
<li>تحضير حلاً أسهم من 100 مغ/مل ديسباسي الثاني بتذويب 30 ملغ ديسباسي الثاني في 300 ميليلتر حبيس مخزنة المالحة (50 مم حبيس/كوه الأس الهيدروجيني 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم). وحدة التخزين هذه للفئران 3-4، ويمكن زيادتها أو أسفل استناداً إلى العدد الفئران للتجربة). ويمكن تخزين هذا المخزون لمدة أسبوع واحد على الأقل في 4 درجات مئوية.</li>
		<li>إعداد حل العامل ديسباسي 2% بإضافة 300 ميليلتر من 100 مغ/مل ديسباسي الثاني الأسهم إلى 1.2 مل دميم العقيمة والجلوكوز عالية وتصفية الحل من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر. وينبغي تنفيذ هذه الخطوة في التدفق الصفحي مجلس الوزراء تحت ظروف معقمة. قبل الحارة ديسباسي استعداد الثاني في حاضنة 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2-الحصول على عيون الفأر
<ol><li>Euthanize الماوس باستخدام أي أسلوب المعتمدة ووضعه على منصة ماصة.</li>
	<li>ارتداء القفازات، وضع الإبهام والسبابة حول العين ودفع الجلد بلطف إلى برتوس مقلة العين.</li>
	<li>إدراج غيض مقص الزاوية بين مقلة العين والجلد وقطع بعناية في العين. لتجنب التلوث، بإيجاز وتراجع العين في الإيثانول 70%.</li>
	<li>فورا مكان العين في مخزنة الفوسفات المالحة (برنامج تلفزيوني) في طبق بتري.</li>
	<li>كرر الخطوات من 2.2-2.4 لإزالة العين الثانية.</li>
</ol>3. تشريح العين
<ol><li>بعناية إزالة النسيج الضام من العين تحت مجهر تشريح. يمكن أن يتم ذلك في برنامج تلفزيوني أو في طبق بتري الجافة.<ol>
<li>استخدام الملقط خياطة لرفع الأنسجة الضامة من مقلة العين، وقطع منها باستخدام مقص فاناس. لا تقطع الصلبة العينية لأنه من المستحيل عمليا الحصول على eyecups الخلفي سليمة إذا تم قطع الصلبة العينية.</li>
		<li>بعد تنظيف النسيج الضام، تبقى مقل العيون الناتجة عن ذلك في برنامج تلفزيوني للغسيل والخطوة التالية. ملاحظة: يجب إجراء كافة الخطوات التالية في التدفق الصفحي مجلس الوزراء تحت ظروف معقمة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>غسل العينين مرتين في حرارة قبل 37 درجة مئوية دميم (ارتفاع السكر). نقل مقل العيون في حرارة قبل 37 درجة مئوية دميم (ارتفاع السكر) باستخدام الملقط بعناية. نضح مقل العيون المتوسطة ونقل إلى متوسطة الطازجة في طبق جديد.</li>
	<li>نضح المتوسطة (ارتفاع السكر) دميم واحتضان العيون في الحل العامل الثاني قبل حرارة 2% (wt/المجلد) ديسباسي لمدة 45 دقيقة في الحاضنة 37 درجة مئوية. ملاحظة: في جميع الخطوات التالية، ضع والتلاعب بعيون أو eyecups في الأجلين المتوسط والنمو، التي سوف تحمي الأنسجة وتوفير وسيلة جيدة للتشريح.</li>
	<li>إزالة الحل الثاني ديسباسي وغسل العينين مرتين في المتوسط النمو يسفط المتوسطة القديمة وإضافة الجديدة المتوسطة النمو قبل حرارة 37 درجة مئوية (الشكل 1a). ملاحظة: بعد الانفصال من جانب ديسباسي الثاني، مقل العيون تصبح لينة.</li>
	<li>عقد العين بالملقط وجعل شق حول سيراتا أورا من كل العين باستخدام مقص فانس تحت مجهر تشريح توضع في التدفق الصفحي مجلس الوزراء.<ol>
<li>حفظ مقلة العين في الحل، بعناية إزالة القرنية الأمامي بتمديد قص حول محيط سيراتا أورا وسحب القرنية الأمامي بعيداً بعد أن تم القطع كاملة.</li>
		<li>إزالة كبسولة العدسة وظهاره قزحية المرتبطة مصطبغة بلطف سحبهم من فنجان العين مع الملقط التقليديهاستخدام (الشكل 1b، ج 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>احتضان eyecups الخلفي الناتجة في نمو متوسطة لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية لتسهيل انفصال الشبكية العصبية RPE.</li>
	<li>قطع eyecups الخلفي إلى 4 بتلات تحت مجهر تشريح توضع في التدفق الصفحي مجلس الوزراء. التخفيضات التي ينبغي أن تكون طويلة بما يكفي لشد فنجان العين، لكن قصيرة بما فيه الكفاية للاحتفاظ بتلات متصلة (الشكل 1 د).<ol>
<li>تسطيح فنجان العين وإزالة الشبكية العصبية عن طريق سحب بلطف جداً مع الملقط أثناء الضغط المتبقية مجمع RPE-المشيمية-الصلبة مع الملقط آخر (الشكل 1e). بدء سحب من الحواف بدلاً من المركز.</li>
	</ol>
</li>
	<li>نقل جميع الأنسجة الذين تم إيواؤهم في طبق ثقافة عقيمة جديدة مليئة بحرارة قبل المتوسطة النمو 37 درجة مئوية.</li>
</ol>4-عزل خلايا RPE أولية
<ol><li>تلة واحدة عقد المجمع RPE-المشيمية-الصلبة الذين تم إيواؤهم مع غرامة سوبر الملقط، تقشر بلطف أوراق سليمة من RPE من الغشاء الركيزة الأساسية (غشاء بروخ 's) باستخدام سكين هلال microsurgical تحت مجهر تشريح وضعت في مجلس الوزراء الاندفاق الصفحي (الشكل 1f).<ol>
<li>نقل الأوراق RPE إلى الطبق ثقافة عقيمة جديدة تحتوي على متوسط النمو باستخدام ميكروبيبيتي P200. عند نقل أوراق RPE، الرطب نصائح ماصة مع متوسط النمو من بيبيتينج عدة مرات لمنع الأنسجة من الخلاف داخل الحافة. RPE سوف يكون واضحا يمكن تمييزها عن المشيمية: RPE تبدو أكثر البنى، بينما المشيمية أغمق وتبدو لزجة ورقيق.</li>
		<li>وبدلاً من ذلك، استخدم الهضم الأنزيمي وتفكك لطيف دون الملقط لفصل RPE من شرويد14.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تغسل الأوراق RPE باستخدام 2-3 مرات قبل حرارة 37 درجة مئوية متوسط النمو في الطبق الثقافة العقيمة. بعد كل خطوة الغسيل، بعناية جمع أوراق RPE مع تجنب الأنسجة الأخرى مثل الحطام الشبكية أو المشيمية. في نهاية الغسيل الماضي جمع أوراق RPE مع ميكروبيبيتي P200 ووضعها في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل جديدة. ملاحظة: ليس هناك حاجة الطرد المركزي الأوراق RPE: أنهم سوف الرواسب بالجاذبية داخل 1 دقيقة.</li>
	<li>إزالة متوسط نمو إضافي استخدام ميكروبيبيتي P200. ريسوسبيند الخلايا في المتوسطة النمو قبل حرارة جديدة وتريتوراتي عليها باستخدام ميكروبيبيتي P200 لطف. تجنب تشكيل الفقاعات. تعليق خلية واحدة مثالية، ولكن أيضا تجنب الكثير من تريتوريشن، وإلا RPE الخلايا غير قادرة على البقاء على قيد الحياة. ونحن نوصي بلطف جداً تريتوريشن عن 40-50 مرة.</li>
</ol>5-استزراع الخلايا RPE
<ol><li>لوحة الخلايا على طبق من ثقافة.<ol>
<li>إذا تتطلب التطبيقات المتلقين للمعلومات من الخلايا RPE الاحتفاظ بهم القطبية، لوحة RPE الخلايا من الفئران 2 في أحد إدراج غشاء البوليستر 12 مم محملة مسبقاً في لوحات الثقافة 12-جيدا. طلاء الخلايا في الكثافة العالية هو المطلوب لأنه في هذه الحالة قادرة على الحفاظ على الخصائص الأصلية، مثل سداسية الشكل وتصبغ الخلايا RPE.</li>
	</ol>
</li>
	<li>لا نقل اللوحة أو تغيير متوسط النمو ح 72 الأولى من استزراع. بعد 3 أيام، تحل محل المتوسطة القديمة مع متوسط النمو قبل حرارة الطازجة. بعد ذلك تغيير ثقافة المتوسط كل يوم. وبمجرد الحصول على خلايا RPE كونفلوينسي، تقليل FBS في المتوسطة النمو إلى 2 في المائة. ملاحظة: يمكن تقسيم الخلايا باستخدام التربسين 0.25%. ومع ذلك، بعد تقسيم قد تفقد الخلايا سداسية الشكل وتصبغ في الفقرات اللاحقة. ونحن لا ننصح بتقسيم الخلايا، ولكن إذا كان مطلوب من قبل تطبيقات المصب الثقافة، ونضع في اعتبارنا أن الخلايا الأولية لا يمكن أن باساجيد إلى أجل غير مسمى: هي معروفة لإزالة التمييز بعد الفقرات 5-7.</li>
</ol>

<ol><li>Martínez-Morales, J. R., Rodrigo, I., Bovolenta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+development%3A+a+view+from+the+retina+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Eye development: a view from the retina pigmented epithelium.</a> Bioessays. 26, 766-777 (2004).</li>
<li>Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+protein+polarity+and+trafficking+in+RPE+cells%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future.</a> Exp Eye Res. 126, 5-15 (2014).</li>
<li>Fronk, A. H., Vargis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+culturing+retinal+pigment+epithelial+cells%3A+a+review+of+current+protocols+and+future+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Methods for culturing retinal pigment epithelial cells: a review of current protocols and future recommendations.</a> J Tissue Eng. 7, (2016).</li>
<li>Rizzolo, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barrier+properties+of+cultured+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Barrier properties of cultured retinal pigment epithelium.</a> Exp Eye Res. 126, 16-26 (2014).</li>
<li>Lu, F., Yan, D., Zhou, X., Hu, D. N., Qu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+melanin-related+genes+in+cultured+adult+human+retinal+pigment+epithelium+and+uveal+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Expression of melanin-related genes in cultured adult human retinal pigment epithelium and uveal melanoma cells.</a> Mol Vis. 13, 2066-2072 (2007).</li>
<li>Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+melanin+and+lipofuscin+in+RPE+cell+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models.</a> Exp Eye Res. 126, 61-67 (2014).</li>
<li>Saini, J. S., Temple, S., Stern, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Retinal+Pigment+Epithelium+Stem+Cell+%28RPESC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Human Retinal Pigment Epithelium Stem Cell (RPESC).</a> Adv Exp Med Biol. 854, 557-562 (2016).</li>
<li>Akrami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+pigment+epithelium+culture%3Ba+potential+source+of+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophthalmic+Vis+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal pigment epithelium culture;a potential source of retinal stem cells.</a> J Ophthalmic Vis Res. 4, 134-141 (2009).</li>
<li>Hu, J., Bok, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+in+studies+of+the+classical+retinoid+visual+cycle+and+retinoid-based+disease+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The use of cultured human fetal retinal pigment epithelium in studies of the classical retinoid visual cycle and retinoid-based disease processes.</a> Exp Eye Res. , 46-50 (2014).</li>
<li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis%3A+use+and+utility+of+RPE+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture.</a> Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).</li>
<li>Reichhart, N., Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+and+transporters+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Ion channels and transporters of the retinal pigment epithelium.</a> Exp Eye Res. 126, 27-37 (2014).</li>
<li>Valapala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal-mediated+waste+clearance+in+retinal+pigment+epithelial+cells+is+regulated+by+CRYBA1%2F%CE%B2A3%2FA1-crystallin+via+V-ATPase-MTORC1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Lysosomal-mediated waste clearance in retinal pigment epithelial cells is regulated by CRYBA1/βA3/A1-crystallin via V-ATPase-MTORC1 signaling.</a> Autophagy. 10, 480-496 (2014).</li>
<li>Shang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+acid+transporter+SLC36A4+regulates+the+amino+acid+pool+in+retinal+pigmented+epithelial+cells+and+mediates+the+mechanistic+target+of+rapamycin%2C+complex+1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The amino acid transporter SLC36A4 regulates the amino acid pool in retinal pigmented epithelial cells and mediates the mechanistic target of rapamycin, complex 1 signaling.</a> Aging Cell. , (2017).</li>
<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nat Protoc. 11, 1206-1218 (2016).</li>
<li>Pfeffer, B. A., Philp, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+of+retinal+pigment+epithelium%3A+Special+Issue%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue.</a> Exp Eye Res. 126, 1-4 (2014).</li>
<li>Singh, S., Woerly, S., McLaughlin, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+and+artificial+substrates+for+retinal+pigment+epithelial+monolayer+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Natural and artificial substrates for retinal pigment epithelial monolayer transplantation.</a> Biomaterials. 22, 3337-3343 (2001).</li>
<li>Sonoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nat Protoc. 4, 662-673 (2009).</li>
<li>Ho, T. C., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+culture+of+retinal+pigment+epithelium+following+isolation+with+a+gelatin+matrix+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+eye+research%22%5BJournal%5D)">Tissue culture of retinal pigment epithelium following isolation with a gelatin matrix technique.</a> Experimental eye research. 64, 133-139 (1997).</li>
<li>Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+three-step+protocol+for+live+imaging+of+intracellular+traffic+in+polarized+primary+porcine+RPE+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers.</a> Exp Eye Res. , 74-85 (2014).</li>
<li>Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+phagocytosis+by+retinal+pigmented+epithelium+that+lacks+myosin+VIIa%2C+the+Usher+syndrome+1B+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 6481-6486 (2003).</li>
<li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Adv Exp Med Biol. 533, 347-352 (2003).</li>
<li>Pitkänen, L., Ranta, V. P., Moilanen, H., Urtti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+retinal+pigment+epithelium%3A+effects+of+permeant+molecular+weight+and+lipophilicity%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Permeability of retinal pigment epithelium: effects of permeant molecular weight and lipophilicity.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 641-646 (2005).</li>
<li>Mao, Y., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis+by+RPE+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture.</a> Methods Mol Biol. 935, 285-295 (2013).</li>
</ol>

س تلقي التمويل من الرعاية الصحية باير ف. هوفمان-لاروش، ألمانيا وسويسرا للبحث. يعلن المؤلفون المتبقية لا تضارب المصالح المالية. ويدعم هذا العمل البحوث "منع العمى" (المنح غير مقيد إلى معهد ويلمر العين وجامعة بيتسبرغ).  ويدعم هذا العمل أيضا أموال بدء التشغيل إلى DS من طب العيون، جامعة بيتسبرغ.

يسمح البروتوكول مفصلاً قدم إنشاء موثوق بها الماوس الثقافات RPE الأولية التي تصل إلى كونفلوينسي بعد أسبوع واحد، وعرض الخصائص RPE الرئيسية مثل سداسية الشكل وتصبغ بعد أسبوعين. يمكن استخدام خلايا RPE التي تم الحصول عليها لعدد من التطبيقات المصب مثل فيتامين (أ) الأيض9، البلعمه من قطاعات الخارجي مستقبله10 وايون النقل11، الخلايا الظهارية قطبية2، الليزوزومية التوازن، وأوتوفاجي،من121...

ظهارة صباغ الشبكية (RPE) هي طبقة واحدة من الخلايا الظهارية الاستقطاب الذي يقع بين الشبكية العصبية والمشيميه في العين. الأداء الوظيفي للخلايا RPE وسلامة أحادي الطبقة RPE حاسمة بالنسبة لرؤية سبب RPE دوراً رئيسيا في عمليات متعددة مثل الحفاظ على حاجز الدم-الشبكية الخارجي، نقل الماء والايونات بين الشبكية شرويد، على ضوء الاستيعاب، الحماية من الأكسدة، والسيطرة على عملية الأيض ريتينويد والبلعمه من الجزء الخارجي من1،فوتوريسيبتورس2. موقع RPE في الجزء الخلفي من العين، فضلا عن وظيفتها حاجز منع المخدرات تدار النظامية من المرور من الدم إلى الزجاجي، تجعل من الصعب على دراسة تعقيد RPE الدالة في فيفو. ومن ثم، هناك حاجة كبيرة لإنشاء RPE الثقافات الخلية لدراسة الخلايا RPE في بيئة مرنة، التي تسيطر عليها3،4.
ويوجد عدد من خطوط الخلايا RPE الراسخة، يوفر طريقة ملائمة وسهولة الحصول عليها وتخزينها في الخلايا؛ ومع ذلك، تحتوي الخلايا باساجيد بعض العيوب مقارنة بالخلايا الأولية2،،من34. أولاً، أنها غالباً ما تتسم بتغييرات في مورفولوجيا الخلايا. على سبيل المثال، لم يعثر أي من خطوط الخلايا الموجودة تكون مناسبة لدراسة موثوقة لخصائص RPE الحاجز بسبب فقدان الخلية القطبية النمط الظاهري واختفاء جزئي تقاطعات ضيق4. بالإضافة إلى فقدان قطبية والسليم خلية إلى خلية اتصالات، خطوط الخلايا RPE سرعان ما يفقد ما تصبغ نظراً للغياب الإنزيمات ميلانوجينيسيس الرئيسية في RPE الكبار5. يمكن استعادة التصبغ، ولكن التحليل الشامل لآلية إعادة تصبغ تشمل مزيجاً من مجهر إلكتروني، الجينات التعبير فحوصات التحليل والمواد الكيميائية للتأكد من وجود الميلانين قد ابدأ وقد أجرى6. القيد أكثر واحد هو أن خطوط الخلايا RPE الحياة الخلية الموسعة (في بعض الأحيان-الخلود) وفي ظل ظروف معينة، يمكن أن تتحول إلى تجديد الذاتي الخلايا الجذعية البالغة multipotent الذي فصل من الركازة وشكل عائم المستعمرات7، 8-هذا القيد يجعل من المستحيل استخدام خطوط الخلية لزرع الأعضاء والتجارب3.
قد RPE الابتدائي خلية الثقافات التي تم الحصول عليها من أنسجة جديدة نظراً لمساوئ خطوط الخلايا RPE المنشأة، بمثابة نموذج ذات صلة أكثر بيولوجيا للدراسة RPE. خلايا أولية RPE قد استخدمت ليس فقط لدراسة مهام محددة RPE مثل الأيض فيتامين (أ)9، البلعمه مستقبله شرائح الخارجي10 وأيون النقل11، ولكن أيضا لدراسة بيولوجيا الخلية الأساسية مثل طلائي قطبية الخلية2 والتوازن الليزوزومية أوتوفاجي،من1213.
في اليومين الماضيين من سنوات كان هناك عدد من المنشورات بشأن إنشاء الأولية RPE الثقافات، مما يشير إلى اهتمام متزايد في هذا المجال من البحوث3،،من1415. البروتوكولات العديدة للخلايا RPE البشرية وغير البشرية RPE الخلايا مثل الخلايا RPE البقر والخنزير وقد نشرت16،17،،من1819. ومع ذلك، أنها أكثر صعوبة في التعامل مع الماوس RPE الخلايا بسبب حجمها أصغر بكثير. على الرغم من أن عددا كبيرا من المنشورات وصف بروتوكولات لعزل الخلايا RPE من الماوس14،،من2021، لا تزال هناك العديد من الباحثين تكافح من أجل عزل الخلايا RPE دون تلوث شرويد الخلايا أو الخلايا من الحطام الشبكية العصبية. وهنا يقدم البروتوكول المتعلق بوضع الماوس الأساسي RPE ثقافة الخلية، بما في ذلك الحصول على العيون من الماوس، وتشريح العيون وعزل الأوراق RPE لإنتاج الخلايا لاستزراع. هذا البروتوكول الفيديو سيكون مفيداً بشكل خاص للباحثين الذين بدأوا العمل مع الماوس الأساسي RPE الثقافات وتحتاج إلى إرشادات بشأن تقنيات التشريح.

<table><tbody><tr><td><قوي >< / قوي></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ~ 3 أسابيع من</td><td></td><td></td><td></td> الفئران</tr> <tr><td>البرية <قوية>الاسم< / قوي></td><td><قوي>الشركة< / قوي></td><td><قوي>رقم الكتالوج</td><td>تعليقات</td></tr><tr><td>recodes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ، ارتفاع الجلوكوز</td><td>GIBCO</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>مصل الأجنة البقري (FBS)</td> <td>سيجما</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)</td><td>جيبكو</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (100X)</td><td>جيبكو</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، 1X ، درجة الحموضة 7.4</td><td>جيبكو</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>هيبس</td><td>سيلجرو</td><td>61-034</td><td></td></tr><tr><td>كيلو أوه</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم</td><td>أمبيون</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>L-جلوتامين (200 ملليمتر)</td> <td>جيبكو</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>كحول إيثيلي</td><td>فيشر 111000200</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>العلميالجسم المضاد RPE65</td><td>هدية من الدكتور مايكل ريدموند</td><td></td><td></td></tr><tr><td>فلوريسين فالويدين &nbsp ؛ &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>F432</td><td></td></tr><tr><td>الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) ، Alexa Flour 568 &nbsp ؛ &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11011 &nbsp ؛ &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>مصل الماعز</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>بارافورمالدهيد (PFA)</td> <td>Polysciences، Inc</td><td>00380</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 الأجسام المضادة متعددة النسيلة</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog رقم< / قوي ></td> <td>< قوي > تعليقات < / قوي ></td></tr> <tr><td>< قوي > الأدوات والمعدات < / قوي ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>خزانة تدفق رقائقي</td><td>بيكر</td><td>SterilGARD SG403A</td><td></td></tr><tr><td>مجهر تشريح (مجهر مجسم تكبير)</td>حاضنة <td>نيكون</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>CO2 مع تعقيم الهواء الساخن</td><td>الموثق</td><td>C150</td><td></td></tr><tr><td>أطباق بتري بطرد مركزي</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td></td><td>أطباق فيشر ساينتفيك</td><td>0875712</td><td></td></tr><tr><td>12 مم إدراج غشاء بوليستر محملة مسبقا في ألواح ثقافة 12 بئر ، حجم المسام: 0.4 وميكرو ؛ م ،</td> مقص قطع الوتر المعقم <td>كورنينج إنكوربوريتد</td><td>COR-3460</td><td></td></tr><tr><td>Westcott ، شفرات STD ،</td><td>أدوات STEPHENS</td> الحادة <td>S7-1320</td><td></td></tr><tr><td>ملقط خياطة Castroviejo 0.12 مم</td><td>أدوات العيون Stroz</td><td>E1796</td><td></td></tr><tr><td>سكين مستقيم</td><td>الهلال Beaver-Visitec International</td><td>373808</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Tweezers # 5 ، 11 سم ، مستقيم ، 0.1x0.06 مم نصائح ، دوموستار</td><td>وورلد للأدوات الدقيقة</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>مقص فاناس، 8 سم، 45 درجة. زاوية ،</td><td>أدوات الدقة العالمية</td><td>القياسية 500260</td><td></td></tr><tr><td>وحدة تصفية حقنة Millex-GS ، 0.22 وميكرو ؛ م</td><td>حقنة</td><td>SLGL0250S</td><td></td></tr><tr><td>ميليبور ، 5 مل</td><td>BD</td><td>309632</td><td></td></tr><tr><td>مجهر مختبر مقلوب &nbsp ؛ لايكا DM IL LED</td><td>&nbsp; Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>حاجز الماصة</td><td>جيلسون</td><td></td><td></td></tr><tr><td>وأطراف الماصة غير المفلترة</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

الثقافات الخلية الأولية من ظهارة صباغ الشبكية الماوس

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

ظهارة صباغ الشبكية (RPE) هو ظهارة متعددة الوظائف عالية استقطاب الذي يقع بين الشبكية العصبية والمشيميه في العين. أنها ورقة واحدة من الخلايا المصطبغة وجبات هاكسغنلي ومتصلة بواسطة تقاطعات ضيق. تشمل المهام الرئيسية ل RPE امتصاص الضوء، البلعمه من الجزء الخارجي مستقبله تسلط، التخزين المؤقت المكانية من أيونات، ونقل المواد الغذائية والايونات والماء، فضلا عن المشاركة النشطة في دورة البصرية. بهذه المهام الهامة والمتنوعة، أنها ذات أهمية حاسمة لدراسة بيولوجيا الخلايا RPE. وقد تم إنشاء عدد من خطوط الخلايا RPE؛ ومع ذلك، المعروف الخلايا باساجيد ومخلدة سرعان ما يفقد بعض الخصائص المورفولوجية والفسيولوجية الطبيعية RPE الخلايا. وهكذا، الخلايا الأولية أكثر ملاءمة لدراسة الجوانب المختلفة لبيولوجيا الخلايا RPE والدالة. الماوس الأساسي RPE خلية ثقافة مفيد جداً للباحثين نظراً لنماذج الماوس تستخدم على نطاق واسع في الدراسات البيولوجية، ومع ذلك جمع RPE الخلايا من الماوس أيضا صعبة للغاية بسبب صغر حجمها. نقدم هنا، بروتوكول لإنشاء الماوس الأساسي RPE خلية الثقافات التي تشمل انوكلييشن وتشريح العيون وعزل الأوراق RPE لإنتاج الخلايا لاستزراع. هذا الأسلوب يتيح استعادة كفاءة الخلية. RPE الخلايا التي تم الحصول عليها من اثنين من الفئران يمكن أن تصل إلى كونفلوينسي في أحد إدراج غشاء البوليستر 12 مم محملة مسبقاً في لوحة الثقافة بعد أسبوع واحد من عرض بعض الخصائص الأصلية لحسن النية RPE الخلايا مثل سداسية الشكل وتصبغ بعد سنتين والثقافة أسابيع للثقافة.

الماوس الأساسي RPE ثقافة المنشأة من الفئران 2 في 12 مم غشاء البوليستر إدراج يصل إلى 90-95% كونفلوينسي بعد أسبوع واحد في الثقافة. بعد أسبوعين ثقافة، وصلت إلى 100% كونفلوينسي الخلايا وبدأ بتشكيل فسيفساء خلايا سداسية والمصطبغة والمنبسطة ثنائية. قبل 3 أسابيع ثقافة، والخلايا تابع لتشكيل الشكل ولون البشرة، ومع ذلك، حصلت جزء من الخلايا بعد 4 أسابيع الصباغ (الشكل 2).
يمكن تقييم نقاء ثقافة الخلية RPE الأولية...

ظهارة صباغ الشبكية (RPE) ظهارة متعدد الوظائف للعين. نقدم هنا بروتوكولا لإنشاء الثقافات الخلية الأولية المستمدة من RPE مورين.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار طريقة مجدية للحصول على خلايا ظهارة صبغية الشبكية من عيون الفئران ، وزراعتها في المختبر مع الاحتفاظ بخصائصها الأصلية. ستساعد هذه الطريقة باحثي RPE على اكتساب مهارات التشريح المطلوبة لإنشاء مزارع خلايا RPE للفئران ، وتوضيح كيفية القيام بذلك بطريقة سهلة. الميزة الرئيسية لهذا الإجراء هي أنه بسيط وممكن.الشيء الوحيد المطلوب هو الممارسة ، ويوضح العرض المرئي لعزل RPE والفحص المجهري حرفيا كيفية الحصول على المهارات المطلوبة. لعزل مقل عيون الفأر ، قم أولا بالقتل الرحيم لفأرين باستخدام أي طريقة معتمدة ، وارتداء القفازات ضعها على وسادة ماصة. ضع إصبع الإبهام والسبابة حول العين وادفع الجلد برفق لانتفاخ مقلة العين.بمجرد بروز مقلة العين ، دس طرف مقص بزاوية بين الجلد ومقلة العين وقم بقص الأنسجة حول العين بعناية حتى يتم تحريرها. بعد ذلك ، اغمس العين المعزولة لفترة وجيزة في 70٪ من الإيثانول واغمرها في PBS في طبق بتري. بعد جمع كلتا العينين من كل من الفئران ، تابع التشريح.تحت المجهر التشريح ، قم بإزالة غالبية الأنسجة الضامة بعناية من حول العين. ليس من الضروري إبقاء العين مغمورة خلال هذه الخطوة. للقيام بذلك ، استخدم ملقط الخياطة لرفع الأنسجة الضامة من مقلة العين ، وقم بقصها باستخدام مقص فاناس.لا تقطع الصلبة لأنه من المستحيل عمليا الحصول على أكواب العين الخلفية السليمة إذا تم قطع الصلبة. بعد تنظيف النسيج الضام ، اغمر مقل العيون في PBS ، وانتقل إلى العمل في خزانة تدفق رقائقي في ظل ظروف معقمة. الآن ، استخدم الملقط لنقل العينين إلى طبق من DMEM الدافئ يحتوي على تركيز عال من الجلوكوز.بعد 20 إلى 30 ثانية ، استبدل محلول الغسيل باستخدام الشفط لغسل ثان. انقل مقل العيون إلى محلول عمل دافئ بنسبة 2٪ Dissopase II في أنابيب سعة 15 مل واترك العينين تحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة للانفصال. بعد الحضانة ، يجب أن تكون مقل العيون ناعمة.بعد ذلك ، اغسل العينين مرتين في نفس الوعاء بوسط نمو دافئ. بعد الغسيل الثاني ، استبدل وسط النمو بوسط طازج ، وانقل مقل العيون والوسط إلى طبق جديد لمواصلة التشريح. استمر في العمل على مقعد نظيف بمساعدة مجهر التشريح.ابدأ التشريح عن طريق تأمين العين بالملقط وقم بعمل شق حول أورا سيراتا باستخدام مقص فاناس. مع الحفاظ على مقلة العين في المحلول ، قم بإزالة القرنية الأمامية بعناية عن طريق تمديد الجرح حول محيط أورا سيراتا. بعد الانتهاء من القطع ، اسحب القرنية الأمامية.بعد ذلك ، قم بإزالة كبسولة العدسة والظهارة المصطبغة بالقزحية المصاحبة عن طريق سحبها برفق من كوب العين باستخدام ملقط مسنن. ثم كرر التشريح على العيون المتبقية واحتضان أكواب العين الخلفية في وسط النمو لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتسهيل فصل الشبكية العصبية عن RPE. بعد 20 دقيقة ، قطعي أكواب العين الخلفية إلى أربع بتلات.اجعل الجروح طويلة بما يكفي لتسطيح كوب العين ، ولكنها قصيرة بما يكفي للحفاظ على البتلات متصلة. بعد ذلك ، قم بتسطيح كوب العين لإزالة الشبكية العصبية. قم بتأمين مركب الصلبة المشيمية RPE المتبقي باليد غير المهيمنة واسحب شبكية العين برفق شديد من الحواف.بمجرد إزالة الشبكية العصبية ، انقل مركب الصلبة المشيمية RPE إلى أرباع إلى طبق ثقافة معقم جديد مليء بوسط النمو الدافئ. في طبق بتري ، قم بتأمين بتلة واحدة من مركب الصلبة المشيمية RPE المقطع إلى أرباع باستخدام ملقط فائق النعومة ، وباستخدام سكين هلال جراحي مجهري ، قم بتقشير صفائح RPE السليمة برفق من الغشاء القاعدي الأساسي. يجب تمييز RPE البني بوضوح عن المشيمية الداكنة واللزجة والرقيقة.بعد ذلك ، بلل طرف ماصة دقيقة p200 بوسط نمو واستخدم الحافة لنقل أوراق RPE إلى الطبق الجديد الذي يحتوي على وسط نمو دافئ. الآن ، اغسل أوراق RPE ثلاث مرات في وسط نمو دافئ. بعد كل خطوة غسيل، اجمع أوراق RPE بعناية مع تجنب الأنسجة الأخرى، مثل الحطام من شبكية العين أو المشيمية.بعد الغسيل الأخير ، انقل صفائح RPE إلى أنبوب سعة 1.5 مل ، واتركها تترسب عن طريق الجاذبية. بعد ذلك ، في خزانة التدفق الصفحي ، قم بإزالة وسط النمو الإضافي وأعد تعليق الخلايا في وسط نمو دافئ حديث. الآن ، قم بتقطيع الأنسجة برفق باستخدام ماصة دقيقة p200 دون عمل فقاعات.ثلاثي بين 40 و 50 مرة ، يكفي فقط لعمل تعليق خلية واحدة. كن حذرا لأن الكثير من التجارب يمكن أن يكون قاتلا. الآن ، قم بوضع خلايا RPE التي تم جمعها من كلا الفئران في غشاء بوليستر واحد سعة 12 مل في بئر صفيحة ثقافة 12 بئر.مطلوب كثافة خلوية عالية بحيث تحتفظ خلايا RPE بشكلها السداسي وتصبغها. وصلت مزرعة RPE الأولية للفأر التي تم إنشاؤها من فأرين في غشاء بوليستر 12 مم إلى 90 إلى 95٪ من التقاء بعد أسبوع واحد في المزرعة. بعد أسبوعين في الثقافة ، كانت الخلايا ملتقية بنسبة 100٪ وبدأت في تكوين فسيفساء من الخلايا السداسية المصطبغة وثنائية النواة.بحلول الأسبوع الثالث ، استمرت الخلايا في التغير في الشكل والتصبغ. ومع ذلك ، بعد أربعة أسابيع ، أصبح جزء من الخلايا مفرط التصبغ. تم تقييم نقاء ثقافة خلايا RPE الأولية باستخدام الجسم المضاد RPE65 ، الذي يصنف الريتينويد isomerohydrolase ، وهو إنزيم مهم للدورة البصرية للفقاريات.تم إثبات سلامة الخلية مع تقاطعات الخلية وشكل الخلية السداسية من خلال تلطيخ الباللويدين. تم تصور التقاطعات الضيقة من خلال تحليل تعبير بروتين ZO-1 ، والذي يمكن تصوره باستخدام صبغة أمينية والتحقق من صحتها عن طريق النشاف الغربي. بشكل عام ، فإن الثقافات قادرة على التكاثر والاحتفاظ بالتصبغ وشكلها السداسي أثناء تشكيل تقاطعات ضيقة والتعبير عن علامات وظيفية ، مثل RPE65.بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل خلايا RPE عن عيون الفأر وزراعتها بشكل صحيح في المختبر. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر دائما إبقاء العينين مبللتين ومحاولة العمل بأسرع ما يمكن.

primary-cell-cultures-from-the-mouse-retinal-pigment-epithelium

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

نحن نقدم طريقة لاستنساخه monolayers زراعة الأجنة البشرية متموجة الخلايا الظهارية في شبكية العين صباغ (hfRPE) الذي يحمل مورفولوجيا الخلايا ، علم وظائف الأعضاء ، قطبية ، والبروتين وأنماط التعبير الجيني للأنسجة الأم الكبار. وقد تم تمديد هذا العمل إلى نموذج حيواني من عدة أمراض العيون.

نماذج تجريبية لدراسة فسيولوجيا صبغات الشبكية الظهارية والفيزيولوجيا المرضية

في هذا الفيديو ، سوف نقوم شرح كيفية عزل الخلايا الجذعية من الظهارة الشبكية الهدبية للعين الماوس وتنمو لهم في مجالات الثقافة لتشكيل نسيلي الشبكية. المجالات التي يتم عزل تمتلك خصائص أساسية للخلايا الجذعية : الذات وتجديد multipotentiality.

عزل الخلايا الجذعية من شبكية العين بالعين ماوس

الشبكية العصبية على فأرة الحاسوب الذين تتراوح أعمارهم بين 8 أيام هي على رأس 4٪ كتلة الجيلاتين. بعد عزل طبقة مبصرة (200 ميكرون) من خلال vibratome، هي المصنفة مبصرات بعد التفكك الميكانيكية والأنزيمية للثقافة. طبقة مستقبلة للضوء يمكن استخدامها لالجزيئية، التحاليل البيوكيميائية أو الزرع.

Vibratome باجتزاء شبكية العين الفأر لإعداد الثقافات مبصرة

يصف البروتوكول النباتات العضوية منشبكية العين العصبيةالماوس , المزروعة جنبا إلى جنب مع ظهارة صبغة الشبكية (RPE), في R16 المتوسطة المحددة, خالية من المصل والمضادات الحيوية. هذه الطريقة بسيطة نسبيا لأداء، وأقل تكلفة، وتستغرق وقتا طويلا بالمقارنة مع التجارب في الجسم الحي، ويمكن تكييفها مع العديد من التطبيقات التجريبية.

على المدى الطويل، زراعة خالية من المصل من النباتات الشبكية الماوس Organotypic مع ظهارة صبغة الشبكية سليمة

يصف هذا البروتوكول ، الذي تم الإبلاغ عنه في الأصل من قبل Fernandez-Godino وآخرون في عام 20161، طريقة لعزل خلايا RPE الماوس والثقافة بكفاءة ، والتي تشكل طبقة أحادية RPE وظيفية ومستقطبة في غضون أسبوع واحد على لوحات Transwell. يستغرق الإجراء حوالي 3 ساعات.

تشريح فعال وثقافة الخلايا الظهارية صبغة الفأر الأولية

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا مبسطا لعزل خلايا الظهارة المصطبغة في الشبكية (RPE) عن عيون الفئران بطريقة تدريجية. يتضمن البروتوكول استئصال وتشريح عيون الفئران ، يليه عزل خلايا RPE وبذرها وزراعتها.

عزل الخلايا الظهارية المصطبغة بالشبكية الأولية للفأر

هنا ، يتم تقديم طريقة سهلة المتابعة لزراعة الخلايا الظهارية الصبغية الصبغية الأولية في المختبر في المختبر .

الثقافة الأولية للخلايا الظهارية الصبغية الشبكية الخنازير

وصفنا طريقة بسيطة وفعالة لعزل خلايا ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) عن عيون خنازير غينيا المصطبغة الصغيرة. يسمح هذا الإجراء بمتابعة دراسات البيولوجيا الجزيئية على RPE المعزول ، بما في ذلك تحليلات التعبير الجيني.

عزل الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية من عيون خنزير غينيا

يحدد هذا البروتوكول إجراءات الحصول على الخلايا الظهارية الصبغية الأولية للشبكية (RPE) واستزراعها من عيون الخنازير من مصادر محلية. تعمل هذه الخلايا كبديل عالي الجودة للخلايا الجذعية وهي مناسبة لأبحاث الشبكية في المختبر .

عزل الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية الأولية للنمذجة في المختبر

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا لعزل خلايا مولر الدبقية في شبكية العين عن عيون الفئران. يبدأ البروتوكول باستئصال وتشريح عيون الفأر ، يليه عزل خلايا مولر وبذرها وزراعتها.

عزل خلايا مولر الدبقية الدبقية لشبكية الفأر الأولية

تعمل ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) كحاجز حاسم بين المشيمية والشبكية ، مما يعزز صحة ووظيفة أنواع خلايا الشبكية ، مثل المستقبلات الضوئية. هنا ، نصف بروتوكولا بسيطا وفعالا لعزل وزراعة الفئران البالغة RPE.

طريقة مبسطة لعزل وزراعة الخلايا الظهارية الصبغية للشبكية من الفئران البالغة

تعلم عزل وزراعة خلايا ظهارة صباغ الشبكية من عيون الفئران مع الحفاظ على خصائصها الأصلية. يوفر هذا البروتوكول البسيط والقابل للتطبيق مهارات التشريح اللازمة لإجراء دراسات علم الأعصاب وعلم الأحياء الخلوية.

الثقافات الخلية الأولية من ظهارة صباغ الشبكية الماوس

استكشف المزيد من الفيديوهات