مقايسة إصلاح غشاء الخلية باستخدام مجهر ليزر اثنين-فوتون

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد قابلية إصلاح غشاء البلازما في خلايا مريض الحثل العضلي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في الحثل العضلي ، مثل العلاقة بين طفرة معينة وحركية إعادة إغلاق الغشاء. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالقياس الكمي في الوقت الفعلي لحركية إعادة ختم الغشاء في الخلايا الحية.

ابدأ بزراعة خلايا الخلايا الليفية في قارورة T225 تحتوي على 40 مل من وسط النمو في حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. عندما تصل المزرعة إلى 70 إلى 80٪ من التقاء ، اشطف الخلايا مرتين باستخدام 40 مل من PBS لكل غسلة ، متبوعا بإضافة خمسة ملليلتر من 0.05٪ تريبسين لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. عندما تنفصل الخلايا ، أوقف التفاعل ب 40 مل من وسط النمو الطازج وقم بزرع ملليلترين من الخلايا بتركيز 100،000 خلية لكل مليلتر في ألواح زجاجية مطلية بالكولاجين مقاس 35 ملم لحضانة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

أضف 150 ميكرولترا من الوسط الطازج المحروم من المصل إلى أنبوب واحد سعة 1.5 مل لكل مزرعة تعداد. بعد ذلك ، أضف ثلاثة ميكرولترات من كاشف النفقة إلى كل أنبوب ، واحتضن الأنابيب لمدة خمس دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة. أثناء احتضان الأنابيب ، أضف 175 ميكرولترا من الوسط المشتق من المصل و 3.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد ديسفيرلين إلى أنبوب إضافي سعة 1.5 ملليلتر لكل لوحة.

ثم امزج 150 ميكرولترا من محلول الحمض النووي البلازميد مع 150 ميكرولترا من كاشف الإرسال في أنبوب جديد واحد لكل لوحة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في صباح اليوم التالي ، استبدل وسط النمو بملليلترين من الوسط المشتق من المصل. في نهاية الحضانة ، قم بتوزيع 300 ميكرولتر بالكامل من محلول البلازميد بالتساوي عبر كل لوحة ، واحتضان الألواح لمدة 24 ساعة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية.

في اليوم التالي ، استبدل المادة الطافية البلازميد بوسط نمو جديد وأعد الألواح إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة أخرى. لتحضير الخلايا لاختبار الجرح ثنائي الفوتون ، اشطف الثقافات المنقولة مرة واحدة باستخدام مليلتر واحد من محلول Tyrode. ثم أضف ملليلترا واحدا من محلول Tyrode الطازج المكمل بميكرولتر واحد من صبغة FM4-64 2.5 مللي مولار إلى الخلايا.

بعد ذلك ، باستخدام مجهر متحد البؤر المقلوب ، قم بإنشاء هدف 0.2 × ميكرون في برنامج المجهر ، وضع الهدف على حافة غشاء الخلية بحيث يتداخل الخط المستهدف ويقع بشكل عمودي على غشاء الخلية. حدد ليزر نيون الهيليوم 543 نانومتر لإثارة إشارة صبغة FM ، وليزر أرجون 488 نانومتر لإثارة إشارة GFP ، واضبط نطاق الكشف على 600 إلى 760 نانومتر و 500 إلى 550 نانومتر على التوالي. ثم قم بإنشاء سلسلة زمنية مدتها خمس دقائق من عمليات مسح الصور المتسلسلة.

لتوليد آفة غشائية ، استخدم ليزر ثنائي الفوتون إلى 820 نانومتر بقوة ليزر 15٪ مع 10 تكرارات لتبييض الخلايا بعد 25 ثانية من بداية السلسلة الزمنية. لتحديد كمية مضان الصبغة FM4-64 ، استخدم البرنامج لرسم منطقة ذات أهمية ستة في ستة ميكرون ، ووضع منطقة الاهتمام المجاورة لموقع الجرح داخل الخلية. ثم اطرح قيمة الخلفية واقسم صافي الزيادة على قيمة التألق في الوقت صفر لحساب قيم التألق النسبية لكل نقطة زمنية.

تظهر خلايا الخلايا الليفية البشرية السليمة مستويات منخفضة من تنشيط التألق FM4-64 بعد الجرح بالليزر بينما تظهر الخلايا الليفية للمرضى غير المعالجة درجة عالية من شدة التألق النسبية بعد الإصابة. تظهر خلايا المريض التي تم نقلها باستخدام بلازميد ديسفيرلين كامل الطول كثافة مضان نسبية منخفضة FM4-64 مقارنة بضوابط المرضى غير المعالجة ولكنها مشابهة لقيم التألق التي لوحظت في الضوابط الصحية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الخلايا ستموت ببطء في المحلول العازل ، لذا اعمل بسرعة وقم بالتغيير إلى خلايا جديدة على فترات منتظمة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تجديد آفات الغشاء باستخدام مجهر ثنائي الفوتون وكيفية تحديد إعادة ختم الغشاء في الوقت الفعلي.