عزل وتوصيف الخلايا التي تبدأ الورم من الساركوما المستمدة من المرضى Xenografts

اكتشفنا أن HLA-I هو وراثيا أسفل ينظم في مجموعة فرعية من الخلايا السرطانية التي تظهر خصائص الخلايا الجذعية والقدرة على بدء الورم. يرتبط الهادون HLA-I بشكل مباشر بالهروب المناعي ، مما يوفر مزايا البقاء على قيد الحياة للخلايا الجذعية السرطانية ، مما يجعل سلبية HLA-I علامة وظيفية دقيقة لهذه الخلايا. ومن خلال هذا الإجراء، سيكون سوديه ايزادمهر، وهو أحد الـ"ما بعد الدكتوراه" من مختبرنا.

عند الحصول على العينة، ضع الأنسجة في طبق بيتري 100 ملليمتر في خزانة السلامة الحيوية المعقمة، وإضافة 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني معقمة إلى الطبق. استخدم مشرطًا معقمة لإعادة تحويل الأنسجة ميكانيكيًا إلى قطع صغيرة حتى لا يزيد حجم جزءها عن 0.1 ملليمتر. نقل كامل حجم 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني من خلال 35 ميكرومتر مسام خلية مصفاة في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.

إضافة 500 ميكرولترات أخرى من برنامج تلفزيوني لشظايا الأنسجة، و mince الأنسجة مرة أخرى. ثم تصفية عظمى من خلال مصفاة الخلية في أنبوب جمع نفسه، والاستمرار في mince قطع الأنسجة حتى يتم فصل العينة تماما. عندما تم جمع آخر حجم من الخلايا، تدور أسفل الخلايا السرطانية عن طريق الطرد المركزي، وإعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من العازلة الانحلال.

بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وجمع الخلايا مع الطرد المركزي آخر، وغسل بيليه مع آخر خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني، وعدد الخلايا القابلة للحياة. تمييع الخلايا إلى مرة واحدة 10 إلى الخلايا السابعة لكل 200 ميكرولترات من تركيز PBS على الجليد ، وإضافة 200 ميكرولترات من مصفوفة غشاء الطابق السفلي إلى الخلايا مع خلط لطيف.

ثم حقن مصفوفة غشاء تعليق الخلية في الطابق السفلي تحت الجلد في الجناح من فأر غاما NOD مُشع، وتحقق من نمو الورم في موقع الحقن مرتين في الأسبوع. عندما يصل الورم إلى سنتيمتر واحد في القطر، وقطع الورم إلى النصف، وإصلاح نصف xenograft مع 4٪ شبهformaldehyde بين عشية وضحاها لتحليل النسيج. معالجة النصف الثاني من الورم كما أظهرت للتو لتحقيق تعليق خلية واحدة، وتمييع الخلايا إلى مرتين 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر من برنامج تلفزيوني تكملها مع تركيز FBS 5٪.

الحفاظ على الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة قبل تقسيم تعليق الخلية بين واحد عنصر تحكم isotype واحد أنبوب الأجسام المضادة. لاحظ عدد الخلايا في كل أنبوب، ومزج الخلايا في أنبوب الأجسام المضادة مع الأجسام المضادة HLA والخلايا في أنبوب التحكم isotype مع جسم مضاد مناسب لمراقبة isotype لاحتضان لمدة 90 دقيقة على الجليد. في نهاية الحضانة، وجمع كل من مجموعات الخلايا عن طريق الطرد المركزي، تليها اثنين من PBS 10 ملليلتر يغسل عن طريق الطرد المركزي.

بعد الغسيل الثاني، إعادة تعليق الكريات في 10 ميكروغرام لكل ملليلتر من DAPI إلى مرة واحدة 10 إلى الخلايا السبع لكل ملليلتر التركيز. ثم قم بتصفية كل تعليق خلية من خلال مصفاة مسام 35 ميكرومتر في أنابيب البوليسترين الفردية 12-75 ملليمتر. بعد فرز الخلايا المنشطة بالفلور، تمييع مجموعات الخلايا السلبية والإيجابية HLA-I إلى فردي مرة واحدة 10 إلى تركيزات الخلايا الخامسة في 15 ملليلتر من القرن الأحمر الأحمر (ساركوسفير) متوسط النمو لكل مجموعة فرعية.

بشكل متسلسل تمييع الخلايا إلى مرة واحدة 10 إلى الرابعة، 10 إلى الثالثة، و 10 إلى التركيزات الثانية في 15 ملليلتر من السركوسفير الطازجة النمو المتوسطة لكل تخفيف، وإضافة 100 ميكرولترات من الخلايا من كل تخفيف إلى كل بئر من واحد 96-جيدا منخفضة جدا لوحة ثقافة خلية المرفقات في التخفيف. ضع اللوحات في حاضنة ثقافة ثاني أكسيد الكربون 5٪ خلية مئوية، ومراقبة تكوين التابوت الأحمر يومياً عن طريق المجهر الخفيف وإضافة عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية الطازجة وعامل نمو البشرة لكل بئر دون تغيير الوسط كل ثلاثة أيام. بعد ثلاثة أسابيع، عد عدد الآبار سالبة للساركوسفير وssarcosphere-سالبة لكل تخفيف الخلية من كل من الخلايا الإيجابية HLA-I وHLA-I للسماح بحساب تردد الخلايا التي تشكل المجال على أساس توزيع احتمال بواسون.

عادة، الإنسان المريض المستمدة ساركوما xenografts تتكون من اثنين من السكان واضح HLA-I-الإيجابية والسلبية، مع الأنسجة مماثلة لتلك التي أظهرتها الوالدين الأولية الورم. يُسهل فرز الخلايا المنشطة بالفلور من الخلايا التي تبدأ الورم المشتق من الساركوما المريض كما هو موضح إثراء عدد كبير من الخلايا السلبية HLA-I من مجموعة الخلايا الأبوية. HLA-I-السلبية الخلايا قادرة على تشكيل المجالات مع المدخلات الأولية من أقل من 10 الخلايا ويحمل قدرة تكوين الورم أعلى من HLA-I-إيجابية ساركوما وصل المريض xenograft الخلايا التي تبدأ الورم.

حقن نفس العدد من الخلايا السلبية والإيجابية HLA-I تحت الجلد في أجنحة معارضة لنفس الماوس يوضح أن الخلايا السلبية HLA-I تمتلك قدرة أكبر بكثير على تكوين الورم. في حين أن xenografts التي شكلتها كل من HLA-I الفرعية السلبية والإيجابية هي الأورام غير متجانسة خلويا. علاوة على ذلك، تحليل التعبير الجيني للخلايا التي تبدأ الورم يكشف أن الخلايا السلبية HLA-I تعبر عن علامات تمايز الخلايا الجذعية ويمكن أن يتم تحريضها على التفريق على طول كل من مسارات الليبوجينية والعظام، مما يدل على وجود بقع قوية للنفط والأحمر-O واليزارين الأحمر-S.

يمكن استخدام هذه الطريقة لعزل الخلايا الجذعية السرطانية في مختلف أنواع السرطان البشرية. والكربن الجزيئي، على سبيل المثال، من خلال تسلسل الجيل القادم قد تكشف عن علامات مشتركة لاستهداف الخلايا علاجيا. اكتشافنا يوضح أن استعادة HLA-I هو خطوة حاسمة لنجاح وحدة وظيفية استراتيجيات زيادة الخلايا المناعية.