إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين الأصلية باستخدام نيوروسفيريس ورم الدماغ مورين

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد إثراء علامات الهيستون في موقع جيني معين. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم التخلق ، مثل كيفية تأثير الطفرات في منظمات الوراثة اللاجينية التي تغير تعديلات الهيستون على نسخ الخلايا السرطانية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الخلايا ليست مترابطة ، لذا فهي في حالة طبيعية أكثر ، مما قد يساعد في خصوصية الجسم المضاد.

ابدأ بتشريح الورم المستحث تجريبيا من دماغ الفأر في طبق بتري طوله 10 سم. إذا كان الورم يعبر عن بروتين فلوري ، فتصور الورم من خلال مجهر تشريح الفلورسنت المضبوطة على قناة الفلورسنت المناسبة بتكبير 0.3 مرة. استخدم مشرطا وملقطا لفصل أنسجة الورم عن الدماغ الطبيعي ، وقم بفرم الورم إلى قطع صغيرة في طبق بتري.

انقل الورم المقطوع إلى أنبوب سعة 1.5 مليلتر يحتوي على 300 ميكرولتر من وسط NSC ، واستخدم حقنة يمكن التخلص منها لتجانس الورم برفق. ثم أضف ملليلترا واحدا من وسط انفصال الخلية، واحتضن العينة لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، قم بتمرير تعليق الخلية عبر مصفاة خلية 70 ميكرون إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.

بعد ذلك ، اغسل المصفاة ب 25 مل من وسط NSC وقم بالطرد المركزي للتعليق عند 300 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد صب المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في ستة ملليلتر من وسط NSC وانقل تعليق الخلية السرطانية إلى قارورة ثقافة T25. زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة بجو 95٪ هواء و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تتشكل المجالات العصبية.

بمجرد حصاد المجالات العصبية ، قم بعمل الطرد المركزي مرة واحدة في 10 إلى خلايا الغلاف العصبي الست لكل ترسيب أميني عند 300 مرة G لمدة خمس دقائق. بعد الطرد المركزي ، قم بصب المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الغلاف العصبي في مليلتر واحد من محلول الملح المتوازن. انقل المعلق إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة ملزمة بالبروتين 1.5 مليلتر ثم أجهزة الطرد المركزي كما كان من قبل.

بعد ذلك ، قم بصب المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 95 ميكرولتر من المخزن المؤقت للهضم ، مكملا واحدا إلى 100 مع كوكتيل مثبط الإنزيم البروتيني لكل مرة واحدة في 10 الخلايا الست. قم بسحب الخلايا على الفور لأعلى ولأسفل لمنع التكتل وتجنب تكوين أي فقاعات. بعد ذلك ، امزج خمسة ميكرولترات من نوكلياز المكورات الدقيقة 0.1X في 145 ميكرولترا من محلول الهضم وأضف خمسة ميكرولترات من نوكلياز المكورات الدقيقة المخففة لكل مرة واحدة في 10 إلى الخلايا الست.

فوق الأنبوب لخلط الأنبوب ووضعه في كتلة حرارية 37 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة بالضبط. يعد هضم نوكلياز المكورات الدقيقة لتفتيت الكروماتين هو الخطوة الأكثر أهمية. يعد تجزئة الكروماتين المناسبة أمرا مهما لتحقيق دقة عالية ل ChIP.

لضمان نجاح الخطوة ، احتضان عينات متعددة واحدة تلو الأخرى لضمان عدم حدوث فرط الهضم. بعد 12 دقيقة ، أضف 10 ميكرولترات من المخزن المؤقت لإيقاف المكورات الدقيقة 10X لكل مرة واحدة في 10 إلى الخلايا الست. يجب حفظ العينات على الجليد من هذه النقطة فصاعدا.

يوضح تحليل المحلل الحيوي لعينة نوكلياز المكورات الدقيقة المهضومة أن معظم الحمض النووي قد تم تقسيمه إلى نيوكليوزومات أحادية وثنائية وثلاثية. بعد ذلك ، أضف 110 ميكرولتر من 2X ripa buffer مكملا بواحد إلى 100 كوكتيل مثبط للبروتياز لكل مرة واحدة في 10 إلى الخلايا الست. قم بنقر الأنبوب للخلط ، ثم جهاز الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية في 1700 مرة G.انقل المادة الطافية التي تحتوي على الكروماتين إلى أنبوب طرد مركزي دقيق عادي سعة 1.5 مل ، وضعه على الثلج.

استخدم المخزن المؤقت ripa المكمل بمثبطات الإنزيم البروتيني من واحد إلى 1000 لتخفيف الكروماتين ، بحيث يكون لكل IP حجم يتراوح من 100 إلى 200 ميكرولتر. بعد ذلك ، قم بإزالة حصة تعادل 10٪ من وحدة تخزين ChIP كعينة إدخال. قم بإعداد المدخلات عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE المكمل بالبروتيناز K ، واحتضانه عند 55 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

بعد تنقية المدخلات باستخدام مجموعة تنقية PCR ، قم بقياس تركيز المدخلات باستخدام مقياس الطيف الضوئي للحجم الصغير. سجل النتائج في دفتر ملاحظات. أضف 10 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المغسول A و G لكل IP سيتم إجراؤه على كل عينة ، واحتضانه لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية مع الدوران عند 20 دورة في الدقيقة.

ضع العينة على حامل مغناطيسي واترك الخرزات تنفصل ، ثم انقل الحجم المطلوب إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 ملليلتر. أضف الجسم المضاد المطلوب إلى كل أنبوب ثم لف الأغطية بغشاء بارافين بلاستيكي لتجنب التبخر. احتضان العينات طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الدوران كما كان من قبل.

في اليوم التالي ، قم بتدوير الأنابيب عند 2000 مرة G لمدة 10 ثوان ، ثم أضف 10 ميكرولتر من الخرز إلى كل IP واحتضانها لمدة 3 ساعات عند 4 درجات مئوية مع الدوران عند 20 دورة في الدقيقة. ثم ضع العينات على حامل مغناطيسي واترك الخرزات المغناطيسية تنفصل. استخدم ماصة لإزالة المادة الطافية ، ثم أضف 150 ميكرولترا من المخزن المؤقت ripa مع مثبطات الإنزيم البروتيني لكل IP واحتضانه عند 4 درجات مئوية عند 20 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.

بعد فترة الحضانة ، ضع العينات على حامل مغناطيسي واترك الخرزات المغناطيسية تنفصل. استخدم ماصة لإزالة المادة الطافية ، ثم أضف 150 ميكرولترا من محلول كلوريد الليثيوم المكمل بمثبطات الإنزيم البروتيني بتركيز منخفض لكل IP ، واحتضانه عند 4 درجات مئوية مع الدوران عند 20 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. بعد فترة الحضانة ، ضع العينات على حامل مغناطيسي واترك الخرزات المغناطيسية تنفصل ، ثم استخدم ماصة لإزالة المادة الطافية.

ثم أضف 150 ميكرولترا من TE البارد بدون مثبطات للبروتياز إلى الخرزات ، واحتضن عند 4 درجات مئوية مع دوران عند 20 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. بعد خطوة الغسيل النهائية ، أعد تعليق العينة في 100 ميكرولتر من عازلة TE المكملة بالتركيز النهائي 0.5 ملليغرام لكل مليلتر بروتيناز K ، واحتضانها عند 55 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. أخيرا ، قم بتنقية الحمض النووي المترسب الأميني باستخدام مجموعة تنقية PCR.

بعد ذلك ، للتحقق مما إذا كان IP ناجحا ، قم بإجراء qPCR باستخدام بادئات تستهدف مناطق التحكم الإيجابية والسلبية. تم إجراء qPCR باستخدام IGG ChIP DNA و histone-3-lycene-4-trimethylated ChIP DNA و histone-3-lycene-27-thrimethylated ChIP DNA ، باستخدام بادئات للجلسرالديهايد -3-فوسفات نازعة هيدروجينيز. تظهر النتائج التمثيلية أن Gapdh ، وهو جين التدبير المنزلي ، يتم إثرائه فقط بتعديل H3K4me3 المرتبط بالنسخ النشط ، وليس تعديل H3K27me3 المرتبط بالكروماتين المكبوت.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل ChIP-C من أجل تحديد التغييرات في علامات الهيستون على مستوى الجينوم. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية أداء ChIP الأصلي في المجالات العصبية لتحديد علامة الهيستون في مواقع جينية محددة.