فوتوكونفيرسيون خلية واحدة في معيشة سليمة الزرد

الهدف العام من تقنية التحويل الضوئي هذه هو التمييز بين الخلايا المفردة في واحد ومجموعات الخلايا الفلورية الأخرى. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة التنموية الرئيسية في هذا المجال ، وتسمح لنا بتصور الهجرة أحادية الخلية بمرور الوقت. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها طفيفة التوغل ويمكن استخدامها لتسمية الخلايا المفردة أو مجموعات أكبر.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للمستخدم تحديد منطقة الاهتمام المحددة وتحويل الصورة للهدف المطلوب. بعد تزاوج الزرد المعدل وراثيا من الذكور والإناث التي تعبر عن بروتين قابل للتحويل الضوئي وجمع البيض وفقا لبروتوكول النص ، استخدم مجهر تشريح بمصدر ضوء 488 نانومتر ومجموعات مرشح GFP لفحص 24 أجنة HPF. باستخدام إبرة أو ملاقط ، قم بفك الأجنة يدويا.

تحضير في الميكروويف ، خمسة ملليلتر من محلول الاغاروز منخفض نقطة الانصهار 0.8٪. بمجرد أن يبرد الاغاروز عند لمسه ، ضع ثلاثة إلى أربعة أسماك مخدرة معدلة وراثيا sox10 eos إيجابية 48 HPF في وسط طبق بتري ذو غطاء زجاجي قابل للانزلاق بغطاء زجاجي بسعة عشرة ملليمترات. أضف ما يقرب من ملليمتر واحد ، أو ما يكفي من الاغاروز لتغطية سطح زلة الغطاء.

بعد ذلك ، استخدم إبرة مسبار لترتيب الأسماك على جوانبها ، وتعديلها حسب الحاجة ، بينما يتجمد الاغاروز ، الأمر الذي سيستغرق حوالي دقيقتين. بعد أن يتجمد الاغاروز لمدة دقيقتين ، أضف ببطء وسط الجنين الذي يحتوي على 0.02٪ من حمض أمينوبنزويك إستر تريكاين إلى الطبق ، حتى يتم غمر السطح السفلي للأجار والطبق. لإجراء الفحص المجهري متحد البؤر ، افتح البرنامج متحد البؤر وحدد نوافذ الالتقاط والتركيز.

لإجراء تصوير ما قبل التحويل، ضمن نافذة الالتقاط وعلامة التبويب المنسدلة لإعداد الالتقاط، حدد معلمات التصوير. فيما يلي إعداد المكدس الخاص بالمختبر يسمى ، تصوير الأسماك. ضع العينة على المجهر متحد البؤر واستخدم مقابض الضبط الخشنة والدقيقة لجعلها في التركيز.

ثم افتح نافذة التركيز وحدد موقع منطقة الاهتمام المطلوبة ، مثل عقدة الجذر الظهري. ضمن قائمة مجموعة المرشح ، حدد ليزر c488 ، واضبط التعرض على 300 مللي ثانية ، وقوة الليزر على خمسة ، وتكثيف إلى 75. بعد ذلك ، ضمن قسم نوع الالتقاط ، حدد مربع 3D.

في قسم التقاط 3D، حدد استخدام الموضع الحالي، وتحقق من النطاق حول التيار. في نفس القسم ، قم بتعيين النطاق إلى 35 ، وعدد الطائرات إلى 36 ، وحجم الخطوة إلى واحد. حدد الموقع الحالي، ثم انقر على البدء في أسفل نافذة الالتقاط للحصول على صورة.

قبل عملية التحويل الضوئي ، تأكد من التحقق المزدوج والثلاثي من معلمات الليزر. في بعض الأحيان يكون من الضروري إعادة ضبط إعدادات التحويل ، عندما تكون نافذة التحويل مفتوحة. في نافذة الالتقاط، ضمن علامة التبويب القائمة المنسدلة إعداد نافذة الالتقاط، حدد إعداد تصوير التحويل الخاص بالمختبر.

هنا يسمى الإعداد الخاص بالمختبر ، استئصال السمك كامل الرقائق. ضمن مجموعة قائمة التصفية ، حدد ليزر c488 و c541. اضبط التعريضات الضوئية على 300 مللي ثانية ، وقوة الليزر على خمسة وتكثيف إلى 75 ، مما سينتج إشارة فلورسنت كافية دون التسبب في التبييض الضوئي أو السمية.

في نافذة التركيز ، انقر فوق علامة التبويب معالجة الصور ، وقم بتغيير طاقة الليزر إلى اثنين ثم انقر فوق انتقال. قم بتغيير حجم كتلة البيانات النقطية إلى واحد وانقر فوق تعيين. ثم قم بتغيير حجم النقر المزدوج إلى أربعة وخط الليزر إلى v405.

بعد ذلك ، في نافذة الالتقاط ، افتح إعدادات الالتقاط المتقدمة. حدد علامة التبويب معالجة الصور وقم بتغيير تكرار النقر المزدوج إلى اثنين، ثم انقر فوق موافق. حدد علامة التبويب xy في نافذة التركيز.

في علامة التبويب المعالجة الضوئية ، تحقق مرة أخرى من معلمات الليزر. بعد ذلك ، قم بتعيين إعدادات الليزر لتحويل الخلية محل الاهتمام ، دون تحويل الصور للخلايا المحيطة. ضمن نوع الالتقاط، حدد مربع الفاصل الزمني، ثم انقر فوق ابدأ.

بمجرد فتح نافذة الفاصل الزمني المباشر ، حدد أداة الدائرة في شريط الأدوات العلوي. ارسم دائرة في أقصى وسط الخلية، ثم انقر بزر الماوس الأيمن فوق الدائرة المرسومة، وحدد منطقة FRAP، وانتظر ثلاث ثوان. يجب أن تصبح المنطقة المحددة باهتة ، عندما تنقر على إيقاف الالتقاط.

إذا كنت تصور أكثر من واحد، فارجع إلى علامة التبويب xy في قائمة التركيز وحدد الموضع الثاني. ثم كرر تحويل الصور. لتحويل مجموعة من الخلايا ، اتبع البروتوكول ومقاييس الليزر من خلال فتح نافذة الفاصل الزمني.

الآن ، بدلا من رسم دائرة لتقسيم منطقة الاهتمام ، استخدم أداة الخط لرسم خط على منطقة الاهتمام. بعد ذلك ، قم بعمل FRAP للمنطقة باستخدام نفس المعلمات الموضحة للتو. بمجرد تحويل جميع النقاط ضوئيا ، ضمن علامة التبويب القائمة المنسدلة لإعداد الالتقاط في نافذة الالتقاط ، حدد إعداد المكدس القياسي الخاص بالمختبر الموضح سابقا في هذا الفيديو.

حدد ليزر c488 واضبط التعرض على 300 مللي ثانية ، وقوة الليزر على خمسة ، والتكثيف إلى 75. حدد ليزر c541 واضبط التعرض على 500 مللي ثانية ، وقوة الليزر على عشرة وتكثيف إلى 75. ضمن قسم نوع الالتقاط ، حدد المربع 3D.

في قسم التقاط 3D، حدد استخدام الموضع الحالي، وتحقق من النطاق حول التيار. في نفس القسم ، اضبط النطاق على 35 ، وعدد الطائرات إلى 36 ، وحجم الخطوة على واحد. قد يزيد رقم النطاق أو ينقص ، لاستيعاب عمق التصوير المطلوب.

إذا كانت هناك نقاط مضاعفة في علامة التبويب التركيز xy، في نافذة الالتقاط، حدد خيار قائمة النقاط المتعددة. إذا لم يكن الأمر كذلك، فحدد الموقع الحالي. أخيرا ، في الجزء السفلي من نافذة الالتقاط ، انقر فوق ابدأ للحصول على صورة.

تظهر هذه اللوحات خلية تحويل واحدة قبل الصورة ، داخل عقدة من سمكة زرد معدلة وراثيا ، تعبر عن بروتين eos القابل للتحويل الضوئي ، تحت سيطرة التسلسل التنظيمي sox10. بعد التحويل الضوئي ، كان eos موجودا بشكل واضح داخل منطقة الاهتمام ، بينما لم يتم تصنيف أي خلايا مجاورة. لإثبات فائدة تقنية التحويل الضوئي هذه ، تعرضت مجموعة من الخلايا في الجانب البطني من الحبل الشوكي للأشعة فوق البنفسجية باستخدام خط.

بعد ذلك ، تم التقاط صور تظهر بروتين eos المحول ضوئيا في منطقة الخط. كان بروتين eos غير المحول ضوئيا مرئيا في جميع المجالات الأخرى. بعد عدة ساعات من التحويل الضوئي ، تم التقاط صور متطابقة أظهرت خلايا إيجابية EOS محولة ضوئيا منتشرة في جميع أنحاء منطقة الحبل الشوكي ، في كل من المواقع الظهرية والبطنية.

تتوافق هذه النتيجة مع الفرضية القائلة بأن الخلايا الشوكية البطنية انتقلت إلى المواقع الظهرية. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في 30 إلى 45 دقيقة ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء تجربة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر التقاط صورة بعد التحويل، للتأكد من أن منطقة اهتمامك قد شهدت تحويل الصور.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التصوير بفاصل زمني من أجل مراقبة الهجرة الخلوية والديناميكيات بمرور الوقت. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التمييز بين الخلايا المفردة داخل مجموعة الخلايا الفلورية. لا تنس أن العمل مع الأشعة فوق البنفسجية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات اللازمة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

على سبيل المثال ، لا تحدق أبدا مباشرة في الضوء.