جمع الأنسجة الدهنية للماوس وتجهيزها لتحليل الحمض النووي الريبي

الهدف العام من هذا الإجراء هو ضمان جمع عينات كافية من مستودعات الأنسجة الدهنية البيضاء من الفئران المختلفة ، وعزل كمية عالية من الحمض النووي الريبي عالي الجودة من الأنسجة. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات التمثيل الغذائي والكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية التي تتعلق ، على سبيل المثال ، بالتعبير الجيني في الأنسجة الدهنية من الفئران المعالجة أو المعدلة وراثيا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بعزل كميات عالية من الحمض النووي الريبي عالي الجودة من الأنسجة الدهنية التي تحتوي عادة على نسبة منخفضة من الحمض النووي الريبي.

ستظهر الإجراء إميلي بيبين ، مساعدة باحثة من مختبري. بعد القتل الرحيم للفأر ، قم بقص الجلد فوق الخط الآلبا وفقا لبروتوكول النص ، ثم قم بعمل شقين بطول سنتيمترين تقريبا من منتصف القفص الصدري باتجاه الذراع اليمنى وبالقرب من الأعضاء التناسلية فوق الطرف الخلفي الأيمن. قم بتمديد أحد أركان الجلد المفتوح واستخدم إبرة قياس 22 لتثبيتها على الوسادة.

ثم قم بتثبيت الزاوية الأخرى. باستخدام مقص جراحي يتم وضعه على الجلد بشكل مسطح قدر الإمكان ، قم بإجراء تشريح حاد للدهون تحت الجلد في البطن ، أو SCF ، ثم انقلها إلى قطعة مقطوعة مسبقا من رقائق الألومنيوم. كرر تشريح الجانب الأيسر من.

بعد ذلك ، اسحب كل من وسادات الدهون المجمعة اليمنى واليسرى في رقائق الألومنيوم واستخدم النيتروجين السائل لتجميد العينة. للوصول إلى الأنسجة الدهنية الحشوية ، قم بقطع عضلة البطن على طول الخط الآلبا. ثم قم بعمل شق في عضلات البطن من الأعضاء التناسلية باتجاه الجزء الخلفي من الفأر على كلا الجانبين.

الدهون حول الأعضاء التناسلية هي الدهون المحيطة بالغدد التناسلية ، أو PGF. افصل وسادات الدهون اليمنى واليسرى عن البربخ والخصيتين والقناة وانقلها إلى رقائق الألومنيوم المسبقة العلامة. ثم قم بتجميد العينة في النيتروجين السائل.

بدءا من الجانب الأيسر ، قم بتعريض الكلى عن طريق تحريك القناة الهضمية بعيدا عن تجويف البطن إلى الجانب الأيمن. الأنسجة الدهنية التي تظهر هنا المحيطة بالكلى والغدد الكظرية هي الدهون حول الكلى ، أو PRF. عزل وإزالة الغدد الكظرية قبل جمع PRF.

قد يكون هذا مملا لأنها وردية قليلا من الأنسجة الدهنية. الآن ، قم بعزل PRF من الجدار العضلي الخلفي وقطع الحالب والشريان الكلوي والوريد الذي يفصل PRF والكلى عن بقية الجسم. بعد ذلك ، قم بعزل PRF عن الكلى عن طريق قطع وإزالة الكبسولة الكلوية.

بعد عزل PRF الأيمن ، انقل العينة إلى رقائق الألومنيوم مع الأنسجة من الجانب الأيسر واستخدم النيتروجين السائل لتجميد العينات. قم بتبريد أنابيب مخروطية خالية من RNase سعة 1.5 ملليلتر وملاط ومدقة وملعقة في النيتروجين السائل وفقا لبروتوكول النص. ضع عينة الأنسجة الدهنية في الهاون ثم استخدم بضع طبقات من الورق البني لرفع المدقة من النيتروجين السائل ووضعها في الهاون.

أثناء إمساك المدقة بالورق ، استخدم المطرقة لضرب الجزء العلوي من المدقة مرة أو مرتين. بعد ذلك ، قم بطحن العينة بحركة دوارة حتى يتم الحصول على مسحوق ناعم. بعد ذلك ، قم بإزالة المدقة ، واسترجع الملعقة من النيتروجين السائل واستخدمها لنقل العينة إلى الأنبوب المخروطي المبرد مسبقا سعة 1.5 مل.

اغمس الملعقة مرة أخرى في النيتروجين السائل من وقت لآخر لمنع العينة من الذوبان. أيضا ، احتفظ بالأنبوب المخروطي على الثلج الجاف لمنع العينة من الذوبان. املأ الأنبوب المخروطي بسعة 2/3 تقريبا بعينة أرضية للحصول على عائد RNA كاف.

ثم قم بإعداد العينات المتبقية وفقا لبروتوكول النص. تحت غطاء كيميائي وأثناء ارتداء معطف المختبر والقفازات ونظارات السلامة ، قم بإزالة عينة أرضية من النيتروجين السائل. افتح الأنبوب ببطء ، وأضف 500 ميكرولتر من محلول الفينول.

أغلق غطاء الأنبوب والدوامة بأقصى سرعة لمدة خمس ثوان تقريبا ، ثم افتح الأنبوب ببطء وحذر لتحرير الضغط من النيتروجين. سيتم سماع صوت الهواء الخارج من الأنبوب. ماصة 500 ميكرولتر إضافي من محلول الفينول في الأنبوب.

ثم ، دوامة وافتحها ببطء كما كان من قبل. دوامة العينة حتى تذوب تماما. ثم افتح الأنبوب لتحرير الضغط قبل معالجة عينات إضافية.

بمجرد معالجة جميع العينات ، قم بدوامها لفترة وجيزة بأقصى سرعة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. الطرد المركزي الأنابيب عند 12،000 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. ثم أعد الأنابيب إلى درجة حرارة الغرفة.

لتجنب التلوث ، لكل عينة ، استخدم ماصة P1000 ذات طرف مفلتر لعزل أكبر قدر ممكن من الحمض النووي الريبي عن الطبقة الوردية الوسطى عن طريق ثقب المرحلة الدهنية بالقرب من جانب الأنبوب. قم بتوزيع الحمض النووي الريبي في الأنابيب المخروطية الجديدة دون لمس جوانب الأنابيب لمنع نقل الدهون الموجودة على السطح الخارجي للطرف. أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم النقي إلى كل عينة واخلط الأنابيب عن طريق الانعكاس لمدة 15 ثانية.

ثم ، بعد احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 12،000 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة وأعد الأنابيب إلى درجة حرارة الغرفة. لكل عينة ، استخدم ماصة P1000 وأطراف مفلترة لنقل أكبر قدر ممكن من المرحلة العلوية المائية الشفافة المحتوية على الحمض النووي الريبي إلى المجموعة الثانية من الأنابيب المخروطية المقابلة. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من الأيزوبروبانول بنسبة 100٪ إلى كل عينة واخلط الأنابيب عن طريق الانعكاس لمدة 15 ثانية.

ثم احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 12،000 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق قبل إعادة الأنابيب إلى درجة حرارة الغرفة. تخلص من الأيزوبروبانول عن طريق سكبه من كل أنبوب.

الآن ، أضف ملليلتر واحدا من 75٪ من الإيثانول إلى كل عينة وقم بدوامة الأنابيب لفترة وجيزة بأقصى سرعة. ثم ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 7 ، 500 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. بعد تدوير العينات وإحضارها إلى درجة حرارة الغرفة ، تخلص من الإيثانول بنسبة 75٪ عن طريق قلب كل أنبوب وإضاءةها على الورق البني لإزالة أي إيثانول متبقي.

اترك الغطاء مفتوحا وجفف حبيبات الحمض النووي الريبي بالهواء لمدة 15 إلى 20 دقيقة. بعد تقييم حجم كريات الحمض النووي الريبي, أضف 10 إلى 25 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase إلى كل عينة. احتضان العينات في كتلة حرارية عند 60 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

ثم ، دوامة الأنابيب لفترة وجيزة. احتضان العينات في نفس الكتلة الحرارية لمدة خمس دقائق إضافية. بعد ذلك ، قم بتدوير جميع العينات بسرعة وضعها على الفور على الجليد.

إجراء RT-PCR للتعبير الجيني في الأنسجة الدهنية وفقا لبروتوكول النص. كما هو متوقع ، زادت الفئران التي تتبع نظاما غذائيا عالي الدهون من وزن الجسم وزيادة الوزن مقارنة بزملائها في النظام الغذائي العادي. كانت هذه الملاحظات مصحوبة بزيادة بأكثر من ضعفين في وزن PGF و PRF و SCF في الفئران البدينة مقارنة بتلك التي تتبع نظاما غذائيا عاديا.

يوضح هذا الجدول أنه لكل نسيج دهني أبيض ، أنتج عزل الحمض النووي الريبي بواسطة محلول الفينول عينات تحتوي على OD260 على OD280 يبلغ حوالي 2.0 والذي يعتبر نقيا للحمض النووي الريبي. كما هو موضح في هذا الرسم البياني الشريطي ، أظهرت بيانات تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي أن تعبير الرنا المرسال للبتين كان أعلى بشكل ملحوظ في PGF و PRF و SCF للفئران البدينة مقارنة بأولئك الذين يتبعون نظاما غذائيا عاديا. لم تكن الاختلافات التي لوحظت في تعبير الرنا المرسال اللبتين ناتجة عن اختلاف في s16 ، وهو الجين المرجعي المستخدم لتطبيع النتائج بين مجموعتي الفئران حيث لم يتم تغيير قيم التصوير المقطعي المحوسب.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر العمل في بيئة خالية من RNase أثناء إجراء استخراج الحمض النووي الريبي. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تعديلات التعبير الجيني.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التمثيل الغذائي لاستكشاف تعديلات الأنسجة الدهنية المتعلقة بالسمنة والسكري في القوارض. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل ضمادات الدهون المختلفة وعزل الحمض النووي الريبي عنها. لا تنس أن العمل بمحلول الفينول يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معطف المختبر والقفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.