انتشار وتمايز السلائف النقوي موريني 32D/ز-CSF-R الخلايا

الهدف العام من هذه التجربة هو تعديل خلايا النخاع العظمي الفأرية 32D-G-CSF-R وراثياً عن طريق زيادة تعبير أو إسكات الجين المستهدف، وتحديد تأثير هذه التغييرات على تكاثر وتمايز الخلايا إلى خلايا متعادلة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال علم الدم، مثل كيفية مشاركة البروتين المستهدف في نمو وتمايز الخلايا السلفية النخاعية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذا الخط الخلوي في امتلاكه قدرة غير محدودة على التكاثر، وقابليته للتعديلات الوراثية، وتكلفته المنخفضة نسبياً، كما أنه يسمح بدرجة من التبسيط البيولوجي المطلوبة في بعض المنهجيات التجريبية. وسيقوم بتوضيح الإجراء اليوم بيتر دانيك، وهو طالب دكتوراه في مختبري.

قم بتحضير 250 milliliters من وسط RPMI-1640 المكمل بـ 10% fetal bovine serum المثبط حرارياً و 10 nanograms per milliliter من murine interleukin-3. ثم قم بتحضير 50 milliliters من وسط التمايز.

في طبق بتري بقطر 16 سنتيمتر، يتم استزراع معلق من الخلايا الفردية من خلايا Bosc23 في 18 مل من وسط DMEM المكمل بـ 10% مصل جنين البقر. تُحضن الخلايا لمدة 24 ساعة تقريبًا حتى تصل نسبة التلاقي إلى 80%. بعد ذلك، يتم دمج بنية الفيروس القهقري MSCV، وناقل التعبئة PCL-echo، والبولي إيثيلين إيمين، ووسط منخفض المصل خالي من المضادات الحيوية. يُحضن هذا الخليط في جهاز Flowbox في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. ثم يُستبدل وسط استزراع خلايا Bosc23 بعناية بـ 16 مل من وسط DMEM المسخن مسبقًا والمكمل بـ 2% مصل جنين البقر والمحفوظ في درجة حرارة 37 درجة مئوية. بعد ذلك، يُضاف خليط الفيروس القهقري قطرة بقطرة على خلايا Bosc23. ثم تُحضن المزرعة في درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات.

بمجرد انتهاء فترة الحضانة، يتم سحب وسط استزراع Bosc23 وإضافة 18 milliliters من وسط DMEM الدافئ مسبقاً والمحتوي على 10%fetal bovine serum. تُحضن الخلايا عند 37 degrees Celsius لمدة 48 hours. استخدم ماصة سيرولوجية سعة 25 milliliter لسحب الوسط الذي يحتوي على فيروس Bosc23 إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. يُحفظ الأنبوب عند four degrees Celsius. بعد ذلك، يتم إضافة 18 milliliters من وسط DMEM الدافئ مسبقاً والمحتوي على 10%fetal bovine serum إلى خلايا Bosc23 وتُستزرع الخلايا لمدة 24 hours.

قم بطرد مركزي للطافي الفيروسي عند 1,500 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. ثم قم بتقسيم الفيروس إلى حصص وتجميده سريعاً باستخدام النيتروجين السائل لتخزينه عند درجة حرارة ناقص 80 درجة مئوية.

في كل بئر من أطباق الزرع ذات الستة آبار، ازرع خلايا NIH/3T3 في ثلاثة ملي لتر من وسط DMEM المدعم بـ 10% fetal bovine serum لتعيين عيار الفيروس. استنبت الخلايا طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. وفي اليوم التالي، خفف الفيروس باستخدام وسط مُدفأ مسبقًا دون رج جزيئات الفيروس باستخدام جهاز الـ vortex. اسحب وسط الاستنبات من خلايا NIH/3T3 وأضف ملي لتر واحد من الفيروس المخفف في كل بئر. حضن الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل. وفي اليوم التالي، اسحب وسط الفيروس المخفف بعناية واستبدله بـ ملي لترين من وسط DMEM مع 10% fetal bovine serum، ثم حضنها مرة أخرى عند درجة حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل. بعد فترة التحضين، اسحب الأوساط القديمة واستبدلها بوسط DMEM يحتوي على puromycin بتركيز ميكروجرامين لكل ملي لتر. استمر في استنبات الخلايا كل ثلاثة أيام، أو في حال تحول لون الوسط إلى الأصفر، وقم بتجديد الوسط بوسط طازج يحتوي على puromycin.

بين اليوم العاشر والثاني عشر بعد العدوى، قم بشفط الوسط من الآبار واغسلها برفق باستخدام محلول ملحي منظم بالفوسفات. ثم صبغها باستخدام واحد مليلتر من محلول البنفسج البلوري في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. بعد الصبغ، اغسل الآبار بعناية باستخدام محلول ملحي منظم بالفوسفات مرتين. قم بعدّ العدد الإجمالي للمستعمرات الزرقاء الموجودة في كل بئر تحت المجهر.

قم باستزراع خلايا 32D-G-CSF-R في طبق سداسي الآبار. أضف الفيروس بتعدد عدوى يتراوح بين 10 و 40. ثم أضف polybrene بتركيز نهائي قدره 8 µg/mL إلى الخلايا واحضنها عند 37 °C لمدة ست ساعات. بعد الحضن، اجمع الخلايا في أنبوب سعة 15 mL وقم بالطرد المركزي عند 450 ×g لمدة خمس دقائق عند 4 °C. قد تفقد خلايا 32D جزئياً قدرتها على التمايز إذا نمت بتركيزات أعلى من 1,000,000 خلية/مل، لذا من المهم جداً تقسيم هذه الخلايا في الوقت المناسب وعدم السماح بفرط نمو المزارع الخلوية.

تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في قارورة زراعة T25 تحتوي على ستة ملليلترات من وسط RPMI-1640 المكمل بـ 10% مصل جنين بقري خامل حرارياً و 10 nanograms per milliliter من الإنترلوكين-3 الفأري. حضن الخلايا عند 37 °C لمدة 48 ساعة.

اغسل خلايا 32D-G-CSF-R مرتين باستخدام وسط RPMI-1640 الخالي من السيتوكينات. بعد ذلك، ازرع الخلايا في واحد ملليلتر من وسط التمايز في طبق يحتوي على 24 بئراً في اليوم صفر، ثم قم بحضنها عند 37 درجة مئوية طوال الليل. ستستغرق الخلايا من سبعة إلى تسعة أيام للتمايز إلى حبيبيات ناضجة. بعد ذلك، قم بعدّ عدد الخلايا باستخدام صبغة trypan blue لاستبعاد الخلايا الميتة.

نظرًا لأن IL-3 قد يثبط عملية التمايز، فمن الضروري للغاية إزالة جميع آثار السيتوكين قبل زراعة الخلايا في GCSF.

قم بإجراء عملية الطرد المركزي للخلايا (Cytospin) على شريحة زجاجية باستخدام جهاز طرد مركزي مع المحولات اللازمة بقوة 20 ×g لمدة خمس دقائق. ثم قم بتثبيت الخلايا في الميثانول لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة واترك الخلايا لتجف. صبغ الخلايا باستخدام صبغة May-Grunwald Giemsa وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. وبمجرد الانتهاء من الصبغ، افحص الخلايا التي امتصت الصبغة باستخدام تكبير 40X.

بناءً على المورفولوجيا الخلوية، قم بقياس عدد الخلايا الأرومية (blasts)، والخلايا المتمايزة جزئياً، والمحببات الناضجة في الخلايا المصبوغة.

يظهر هنا تمثيل رسومي يوضح تكاثر خلايا 32D-G-CSF-R في أوساط تحتوي على إنترلوكين-3 وعامل تحفيز مستعمرات الخلايا المحببة. يمثل المحور السيني أيام المعالجة، بينما يمثل المحور الصادي عدد الخلايا بمقياس لوغاريتمي. يوضح المخطط الأسود التكاثر عند زراعة الخلايا في وسط يحتوي على إنترلوكين-3. ويوضح المخطط الأزرق انخفاض تكاثر الخلايا عند زراعتها في وسط يحتوي على عامل تحفيز مستعمرات الخلايا المحببة.

تظهر هنا مخططات دائرية تمثيلية وصبغة May-Grunwald Giemsa توضح نسبة ومورفولوجيا تمايز خلايا 32D-G-CSF-R في وسط يحتوي على عامل تحفيز مستعمرات الخلايا المحببة. توضح المخططات الدائرية نسبة الخلايا الأرومية، والخلايا ذات التمايز المتوسط، والخلايا المتعادلة عند المعالجة بعامل تحفيز مستعمرات الخلايا المحببة في الأيام صفر، واثنين، وأربعة، وستة. تتميز الخلايا المصبوغة بصبغة Giemsa في اليوم صفر بنوى كبيرة مميزة وسيتوبلازم داكن. وفي اليوم السادس، يقل حجم النواة ويتوسع السيتوبلازم ولكنه لا يكون داكناً.

تظهر هنا مخططات دائرية تمثيلية توضح النسبة الأعلى من الخلايا الأرومية (blast cells) عند نقل بروتينات BCR-ABL الاندماجية مقارنة بنواقل MSCV الضابطة في أوساط تحتوي على عامل تحفيز مستعمرات الخلايا الحبيبية. وتعتبر صبغة Giemsa في اللوحة السفلية تمثيلية للخلايا عند نقل البروتينات الاندماجية BCR-ABL أو النواقل الضابطة.

خضعت الخلايا لتمايز عدلي في اليوم السادس عند نقل ناقل MSCV الضابط إليها، بينما أظهرت الخلايا التي نُقل إليها BCR-ABL معظمها خلايا أرومية ولم تظهر أي عدلات ناضجة.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في يومين إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة إجراء هذا البروتوكول، من المهم تذكر استزراع خلايا 32D-G-CSF receptor بالتركيزات المحددة. وعقب هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل فحوصات الهجرة وتجارب البقاء للإجابة على تساؤلات إضافية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعامل مع الخط الخلوي 32D-G-CSF receptor، بما يشمل التعديل الوراثي عن طريق ترانسدكشن الفيروسات العدسية والفيروسات الارتجاعية، والتوسيع، والتمايز، وتقييم تكاثر وتمايز هذه الخلايا. ولا تنسَ أن العمل مع الفيروسات قد يكون خطيرًا، لذا يجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات والنظارات الواقية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.