انتشار وتمايز السلائف النقوي موريني 32D/ز-CSF-R الخلايا

الهدف العام من هذه التجربة هو التعديل الجيني لخلايا الفئران النخاعية 32D-G-CSF-R عن طريق الإفراط في التعبير عن الجين المعني أو إسكاته وتحديد تأثير هذه التغييرات على التكاثر والتمايز العدلي لخط الخلية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أمراض الدم مثل كيف يمكن أن يشارك البروتين الذي يثير اهتمامك في نمو وتمايز الخلايا السلائف النخاعية. الميزة الرئيسية لهذا الخط الخلوي هي أنه يمتلك قدرة انتشار غير محدودة ، وعرضة للتلاعب الجيني ، والتكلفة منخفضة نسبيا ، وتسمح بدرجة من التبسيط البيولوجي المطلوبة في بعض الأساليب التجريبية.

سيوضح الإجراء اليوم بيتر دانيك ، طالب الدكتوراه في مختبري. تحضير 250 مل من RPMI-1640 Medium مع مصل بقري جنيني 10٪ معطل بالحرارة و 10 نانوجرام لكل ملليلتر من إنترلوكين الفئران -3. ثم تحضير 50 مل من وسط التمايز.

في طبق بتري 16 سم ، معلق أحادي الخلية من خلايا Bosc23 في 18 مل من وسط DMEM مكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪. استزراع لمدة 24 ساعة تقريبا حتى يصل التقاء إلى 80٪ ثم الجمع بين بنية الفيروسات القهقرية MSCV ، ناقل تغليف صدى PCL ، بولي إيثيلينيمين ، وتقليل وسط المصل بدون مضادات حيوية. احتضن هذا الخليط في Flowbox في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

ثم استبدل بعناية وسط زراعة الخلايا Bosc23 ب 16 مل من وسط DMEM الدافئ مسبقا مع مصل بقري الجنين بنسبة 2٪ يتم الحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف خليط الفيروسات القهقرية على خلايا Bosc23. ثم احتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات.

بمجرد انتهاء الحضانة ، استنشق وسط مزرعة Bosc23 وأضف 18 مل من وسط DMEM الدافئ مسبقا مع مصل بقري للجنين بنسبة 10٪. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. استخدم ماصة مصلية سعة 25 مليلتر لسحب الوسط المحتوي على فيروس Bosc23 إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

قم بتخزين الأنبوب عند أربع درجات مئوية. ثم أضف 18 مل من وسط DMEM الدافئ مسبقا مع مصل بقري الجنين بنسبة 10٪ إلى خلايا Bosc23 وقم بزراعة الخلايا لمدة 24 ساعة. جهاز الطرد المركزي للطافي الفيروسي عند 1 ، 500 مرة جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

ثم قم بتقطيع الفيروس وقم بتجميده بالنيتروجين السائل لتخزينه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. في كل بئر من صفيحة من ستة آبار ، بذور خلايا المعاهد الوطنية للصحة / 3T3 في ثلاثة ملليلتر من وسط DMEM مكملة بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ لفيروس واحد. استزراع الخلايا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.

في اليوم التالي ، قم بتخفيف الفيروس بوسط دافئ مسبقا دون دوامة الجزيئات الفيروسية. استنشق وسط الثقافة من خلايا المعاهد الوطنية للصحة / 3T3 وأضف ملليلتر واحد من الفيروس المخفف في كل بئر. احتضن عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

في اليوم التالي ، قم بشفط الوسط الفيروسي المخفف بعناية واستبدله بملليلترين من وسط DMEM بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ واحتضانه مرة أخرى عند 37 درجة مئوية طوال الليل. بعد الحضانة ، قم بشفط الوسائط القديمة واستبدلها بميكروغرامين لكل مليلتر من وسط DMEM المحتوي على البيورومايسين. استمر في زراعة الخلايا كل ثلاثة أيام أو ما لم تتحول الوسائط إلى اللون الأصفر وتجدد بوسائط جديدة تحتوي على البيورومايسين.

بين اليوم العاشر والثاني عشر بعد الإصابة ، قم بشفط الوسائط من الآبار واغسلها برفق بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات. ثم وصمة عار بملليلتر واحد من محلول البنفسجي البلوري في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. بعد التلوين ، اغسلها بعناية بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات مرتين.

احسب العدد الإجمالي للمستعمرات الزرقاء الموجودة في كل بئر تحت المجهر. قم بزرع خلايا 32D-G-CSF-R في طبق من ستة آبار. أضف الفيروس في تعدد العدوى بين 10 و 40.

ثم يضاف البوليبرين إلى التركيز النهائي البالغ ثمانية ميكروغرام لكل مليلتر إلى الخلايا ويحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ست ساعات. بعد الحضانة ، قم بتجميع الخلايا في أنبوب سعة 15 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 450 مرة جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. قد تفقد الخلايا 32D جزئيا قدرتها على التمايز إذا نمت إلى تركيزات أعلى من مليون خلية لكل مل.

لذلك ، من المهم جدا تقسيم هذه الخلايا في الوقت المحدد وعدم نمو الثقافات. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في قارورة ثقافة T25 تحتوي على ستة ملليلتر من RPMI-1640 Medium مكملا بمصل بقري جنيني 10٪ معطل بالحرارة و 10 نانوجرام لكل مليلتر من إنترلوكين الفئران -3. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.

اغسل خلايا 32D-G-CSF-R مرتين باستخدام RPMI-1640 Medium بدون السيتوكينات. ثم قم بزرع الخلايا في مليلتر واحد من وسط التمايز في صفيحة مكونة من 24 بئرا في اليوم صفر وتحتضن عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. ستستغرق الخلايا من سبعة إلى تسعة أيام للتمايز إلى خلايا حبيبية ناضجة.

ثم احسب عدد الخلايا التي تستخدم التريبان الأزرق لاستبعاد الخلايا الميتة. نظرا لأن IL-3 قد يثبط عملية التمايز ، فمن الأهمية بمكان إزالة جميع آثار السيتوكين قبل زراعة الخلايا في GCSF. قم بتدوير الخلايا على شريحة زجاجية في آلة الطرد المركزي باستخدام المحولات اللازمة عند 20 مرة جم لمدة خمس دقائق.

ثم قم بإصلاح الخلايا في الميثانول لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة واترك الخلايا تجف. قم بتلطيخ الخلايا باستخدام تلطيخ May-Grunwald Giemsa باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. بمجرد تلطيخها ، تخيل الخلايا التي أخذت البقعة باستخدام تكبير 40X.

بناء على التشكل الخلوي ، حدد عدد الانفجارات والخلايا المتمايزة وسيطا والخلايا المحببة الناضجة في الخلايا الملطخة. يظهر هنا تمثيل رسومي يوضح تكاثر خلايا 32D-G-CSF-R في عامل تحفيز مستعمرة الإنترلوكين -3 والخلايا المحببة المحتوية على الوسائط. يمثل المحور السيني أيام العلاج.

يمثل المحور y عدد الخلايا في المقياس اللوغاريتمي. تظهر المؤامرة السوداء تكاثرا عندما يتم زراعة الخلايا في وسط يحتوي على إنترلوكين -3. تظهر المخطط الأزرق انخفاضا في تكاثر الخلايا عند زراعتها في عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة الذي يحتوي على وسط.

تظهر هنا مخططات دائرية تمثيلية وتلوين May-Grunwald Giemsa يوضح النسبة ومورفولوجيا التمايز لخلايا 32D-G-CSF-R في عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة المحتوي على وسط. توضح المخططات الدائرية نسبة الانفجارات والخلايا المتمايزة متوسطا والعدلات على معالجة عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة عند صفر ويومين وأربعة وستة أيام. تحتوي خلايا Giemsa الملطخة في اليوم صفر على نوى مميزة كبيرة وسيتوبلازم داكن.

في اليوم السادس ، يتم تقليل الحجم النووي ويتضخم السيتوبلازم ولكن ليس داكنا. تظهر هنا مخططات دائرية تمثيلية توضح النسبة الأعلى من الخلايا المتفجرة عند تحويلها ببروتينات اندماج BCR-ABL مقارنة بناقل MSCV للتحكم في عامل تحفيز مستعمرة الخلايا الحبيبية المحتوي على الوسائط. يمثل تلطيخ Giemsa في اللوحة السفلية الخلايا عند تحويله ببروتينات التحكم أو الاندماج BCR-ABL.

خضعت الخلايا للتمايز العدلي في اليوم السادس عند نقلها بناقل التحكم في MSCV ، لكن الخلايا المنقولة BCR-ABL أظهرت في الغالب خلايا انفجارية ولا توجد عدلات ناضجة. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون يومين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر زراعة خلايا مستقبلات 32D-G-CSF بتركيزات محددة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل فحوصات الهجرة وتجارب البقاء على قيد الحياة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعامل مع خط خلايا مستقبلات 32D-G-CSF الذي يغطي التلاعب الجيني عن طريق نقل الفيروسات العدسية والفيروسات القهقرية ، والتوسع ، والتمايز ، وتقييم تكاثر وتمايز هذه الخلايا. لا تنس أن العمل مع الفيروسات يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات والزجاج الواقي أثناء تنفيذ هذا الإجراء.