العلاج التوافيقيه Trichostatin A وفيتامين ج يحسن كفاءة استنساخ الفئران بنقل نواة الخلية الجسدية

الهدف العام من هذه التجربة هو تحسين كفاءة إنتاج الأجنة المعاد بناؤها والفئران المستنسخة باستخدام النقل النووي للخلايا الجسدية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأحياء الأساسي وعلم الأحياء التنموي وإنقاذ مجال المهددة بالانقراض. مثل التطور الجنيني والبرمجة النووية والحفاظ على البحوث الجينية.

الميزة الرئيسية لهذه الطريقة والتقنية هي أنه من الممكن توليد فئران مستنسخة بمستوى عملي من الكفاءة بإجراءات بسيطة. بعد تحضير وسط الاستزراع وفقا لبروتوكول النص ، قم بإذابة 1.2 جرام من BSA في 10 مل من الماء المعقم بدرجة حرارة الغرفة. أضف ما يقرب من 0.12 جرام من حبات راتنج التبادل الأيوني المختلطة إلى محلول BSA في درجة حرارة الغرفة مع التحريك اللطيف.

عندما يتغير لون الخرزات من اللون الأزرق والأخضر إلى الذهبي ، استخدم ماصة لاستعادة المحلول الطافي ، ثم استبدل الخرزات بدفعة جديدة. بعد التأكد من أن الخرز الطازج لا يتغير لونه ، استرجع المحلول. ثم أضف 250 ميكرولتر من بيكربونات الصوديوم 10.5٪.

باستخدام مرشح 0.45 ميكرون ، قم بتعقيم المادة الطافية ، ثم قم بتسميتها كمحلول مخزون DBSA وقم بتخزينها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. بعد إجراء القتل الرحيم على إناث الفئران المعرضة للإباضة الزائدة وفقا لبروتوكول النص ، استخدم تقنيات التشريح القياسية لشق البطن للوصول إلى الجهاز التناسلي. باستخدام مقص صغير مستقيم وملاقط ، قم باستئصال قنوات البيض ونقلها إلى ورقة ترشيح لمسح الدم من السطح.

بعد ذلك ، اضبط قنوات البيض في الزيت المعدني ، ثم استخدم إبر التشريح لتقطيع أمبولة قناة البيض ونقل مجمعات البويضات الركامية القادمة من الأمبولة إلى 200 قطرة ميكرولتر من وسط HCZB مع 0.1٪ هيالورونيداز. احتضن الأنسجة على طبق تسخين لمدة خمس دقائق. تحت المجهر المجسم ، تأكد من إطلاق الخلايا الركامية من مجمعات البويضات الركامية ، ثم انقل بويضات مرحلة الطور الانتصافي الثاني أو M2 مع بعض الخلايا الركامية المتبقية إلى وسط MKSOM الذي يحتوي على 0.3٪ DBSA.

اغسل بويضات المرحلة M2 أربع مرات عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل في الوسط لفصل الخلايا الركامية المتبقية. ثم احتضان البويضات في وسط عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى الاستئصال. لعزل البويضات المجردة من مجمعات البويضات الركامية ، تحت مجهر مجسم أثناء استخدام ماصة ، قم بنقل عدد صغير من الخلايا الركامية المتبقية المنتشرة من مجمعات البويضات الركامية إلى وسط HCZB مع 6٪ DBSA.

ضع الخلايا الركامية على صفيحة الاحترار عند 37 درجة مئوية لحين الحاجة إلى النقل النووي للخلية الجسدية أو نقل نواة الخلية الجسدية. بعد تحضير محاليل مخزون PVP المتوسطة و CB وفقا لبروتوكول النص ، استخدم ماصة معقمة تحتوي على 20 ميكرولتر من وسط HCZB تحتوي على خمسة ميكروغرامات لكل ملليلتر من CB لغسل بويضات المرحلة M2. بعد تكرار الغسيل خمس مرات ، احتضان البويضات في محلول الاستئصال على لوح التسخين لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، قم بإعداد غرفة الاستئصال ، ثم استخدم ماصة لنقل البويضات M2 إلى الغرفة. أضف أربعة ميكرولترات من محلول الاستئصال وقم بتغطية الغرفة بالزيت المعدني. تحت المجهر في درجة حرارة الغرفة ، حدد مغازل وكروموسومات بويضة المرحلة M2.

ثم باستخدام ماصة ثابتة وماصة دقيقة، قم بتوجيه البويضة بجسم قطبي أول واضح بحيث يكون موضع المغزل والكروموسوم في موضع 3:00 أو 9:00. اضبط شدة نبضة البيزو على ثلاثة إلى ستة ، وباستخدام ماصة المعالجة الدقيقة ، قم بالحفر في المنطقة الشفافة وافتح ثقبا فيها. ثم مع الحد الأدنى من السيتوبلازم ، قم بإبعاد المغازل والكروموسومات تماما.

تحت الضوء المرئي ، تأكد من عدم وجود كروموسومات في السيتوبلازم ، ثم باستخدام وسط MKSOM الذي يحتوي على 0.3٪ DBSA يفتقر إلى CB ، اغسل البويضات المنزوعة النواة جيدا. احتضان الطبق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى اندماج الخلايا. لتحضير HBJE، أضف 260 ميكرولترا من محلول التعليق HBJE المثلج إلى HVJ-E المجفف بالتجميد ، وقم بتسخينه لأعلى ولأسفل حتى يتم تعليقه بالكامل.

قم بإعداد خمسة ميكرولتر من المحلول وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى اندماج الخلايا. لإجراء اندماج الخلايا ، استخدم 20 ميكرولترا من المخزن المؤقت لدمج الخلايا لتخفيف خمسة ميكرولترات من محلول HVJ-E. ضع محلول HBJE المخفف على الثلج حتى الاستخدام.

بعد تحضير غرفة اندماج الخلايا كما هو موضح هنا ، استخدم ماصة لنقل البويضات المنزوعة النوم إلى وسط HCZB في الغرفة. أضف أربعة ميكرولترات من كل محلول كما هو موضح ، واستخدم ما يقرب من ملليلتر واحد من الزيت المعدني لتغطية الغرفة. ضع الغرفة مع البويضات المنزوعة النوم في درجة حرارة الغرفة تحت المجهر بتكبير 400 مرة.

ثم باستخدام ماصة المعالجة الدقيقة ، انقل الخلايا المانحة إلى محلول تعليق HVJ-E. استنشق الخلايا الركامية واحدة تلو الأخرى لفصلها بالتساوي عن بعضها البعض ، مما يتيح اندماج الخلايا التسلسلية. ثم باستخدام ماصة ثابتة ، احتفظ بالبويضات المنزوعة النواة في وسط HCZB واستخدم نبضة البيزو مع ماصة المعالجة الدقيقة لحفر المنطقة الشفافة.

بعد فتح الثقب في المنطقة الشفافة ، قم بعمل ماصة خلية ركامية بحجم حوالي خمسة أضعاف حجم محلول HVJ-E وطردها بإحكام في غشاء البويضة دون المرور عبر الغشاء. بعد التلاعب باندماج الخلايا ، انقل البويضات على الفور إلى وسط MKSOM الذي يحتوي على 0.3٪ DBSA ، وانقلها إلى حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. يجب إكمال الخطوات الموضعية في غضون 10 دقائق من وضع البويضات المنزوعة النواة في وسط HCVB تحت المجهر إلى إعادتها إلى الحاضنة.

بعد اندماج الخلايا ، تحت المجهر عند تكبير 400x ، تحقق من تكثيف الكروموسوم المبكر في البويضات المعاد بناؤها. انقل البويضات المعاد بناؤها إلى وسط التنشيط الذي يحتوي على التريكوستاتين A ، أو TSA واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في الهواء لمدة ست ساعات. لاحظ تكوين النوى في أجنة SENT ، ثم ضع ساعتين أخريين من علاج TSA في وسط MKSOM مع 0.3٪ TBSA.

قم بإجراء علاج فيتامين سي وفقا لبروتوكول النص. كما هو موضح في هذا الجدول ، أظهر علاج TSA وفيتامين C على بويضات الفئران المستنسخة معدلا عاليا جدا من التكوين النووي وتطور إلى مرحلة الخليتين في جميع الظروف. تم نقل بعض الأجنة المستنسخة ، المشتقة من الخلايا الركامية وتطورت إلى مرحلة الخليتين إلى قنوات البيض للإناث الحوامل الزائفة.

يوضح هذا الشكل ستة ذرية مستنسخة تطورت من بين 72 جنينا منقولة تم إنتاجها من ثلاث إناث حوامل عن طريق المعالجة التسلسلية ل TSA وفيتامين C. أخيرا ، كما هو موضح هنا ، أدى العلاج باستخدام TSA و VC إلى تحسين كفاءة التطور الجنيني في المختبر إلى مرحلة الكيسة الأريمية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن جميع الوسائط والكواشف الضرورية معدة مسبقا. الإجراء نفسه سهل المتابعة ومواد معدة جيدا سيضمن تحقيق النتائج المتوقعة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنتاج البويضات المعاد بناؤها.