بروتوكول بسيط عالي الكفاءة لعزل الجزيرة البنكرياسية عن الفئران
أغسطس 30, 2019
وصف بروتوكول عزل الجزيرة هذا مسارًا جديدًا لحقن الكولاجين لهضم الأنسجة الخارجية وإجراء تدرج مبسط لتنقية الجزر من الفئران. وهو ينطوي على الهضم الأنزيمي، فصل التدرج / تنقية، ومجموعة انتقاء اليد. يمكن أن ينتج عن العزل الناجح 250-350 جزيرة عالية الجودة وكاملة التشغيل لكل ماوس.
ويتطلب هذا البروتوكول استخدام تدرج كثافة واحد مما يجعله أقل كثافة عمالة بكثير وأكثر فعالية من حيث التكلفة مقارنة بأساليب عزل الجزر التقليدية الأكثر تعقيداً. والميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو أن يتم تسليم الانزيم مباشرة إلى البنكرياس مما يؤدي إلى تحسين هضم الأنسجة وزيادة العائد الجزير. تبدأ عن طريق تسجيل أطراف الماوس في موقف سوبين ورش الجسم مع 70٪ الإيثانول.
باستخدام ملقط غطاء ومقص جراحي منحني، وجعل ما يقرب من ثلاثة سنتيمترات شق الجلد البطن الأفقي وسحب فتح الجلد لفضح جدار البطن. إجراء شق عمودي من ثلاثة إلى أربعة سنتيمترات على الصفاق البطني لفضح البنكرياس بشكل كامل ووضع الماوس تحت مجهر تشريح. دفع الفص الكبدي بتفوق لفضح القناة الصفراوية التي تظهر على أنها أنبوب وردي شاحب وتحريك الأمعاء بلطف من المنطقة اليمنى من أسفل الظهر والخفيف إلى يمين تجويف البطن لفضح القناة الصفراوية والشريان الكبدي.
استخدام شوارتز micro serrefines لتضييق الخناق بعناية على القناة الصفراوية المشتركة في أقرب وقت ممكن إلى الكبد وتحديد أمبولا فاتر الذي يقع في papilla الاثني عشر والتي شكلتها اتحاد القناة البنكرياسية والقناة الصفراوية المشتركة. باستخدام ملقط Adson الصغيرة لسحب القناة الصفراوية المشتركة التي تدرس، إدراج إبرة نصف بوصة قياس 30 تعلق على حقنة ثلاثة ملليلتر تحتوي على ثلاثة ملليلتر من محلول الكولاجين P الطازجة في أمبولا فاتر دفع الإبرة في مجرى موازية للسفينة لحوالي ربع طول السفينة. مرة واحدة في الإبرة في مكانها، وتحقيق الاستقرار في الإبرة مع ملقط Adson الصغيرة وحقن ببطء وبثبات ثلاثة ملليلتر من محلول الكولاجيناز P في القناة.
تعتبر الحقن ناجحة إذا كانت مناطق الرأس والرقبة والجسم والذيل من البنكرياس مضخمة بالكامل. دخول السليم في ampulla وتكبيل القناة الصفراوية المشتركة حاسمة لنجاح حصاد الهضم. ثقب الجدران القناة يقلل من فعالية العزلة.
باستخدام ملقط Adson المنحنية والصغرى ، اسحب البنكرياس المنتفخ بعناية بدءًا من الطحال والاستمرار في المعدة وعلى طول الاثنيث. ثم ضع البنكرياس في أنبوب هضم 50 ملليلتر يحتوي على ثلاثة ملليلترات من محلول الكولاجيناز P البارد. لحصاد الجزر الصغيرة، استخدم أولاً مقصاً جراحياً دقيقاً لختم البنكرياس لمدة ثلاث إلى خمس ثوانٍ قبل وضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية بمعدل 100 إلى 120 دورة في الدقيقة لمدة 12 إلى 13 دقيقة.
في نهاية الحضانة، يهز بلطف الأنبوب لمدة 30 ثانية لتعطيل الأنسجة حتى يكون الحل متجانساً كما تؤكده جزيئات أنسجة البنكرياس الدقيقة الشبيهة بالرمال. بمجرد هضم الأنسجة ، ضع الأنبوب على الثلج وأضف 40 ملليلترًا من محلول توقف الجليد البارد لإنهاء التفاعل الأنزيمي. بعد تعطيل بلطف بيليه، تدور أسفل الأنسجة المهضوضة في جهاز طرد مركزي دلو يتأرجح تليها اثنين من الطرد المركزي مع 20 ملليلتر من محلول وقف جديد لكل غسل.
بعد الغسيل الأخير، resuspend بيليه في 40 ملليلتر من الجليد HBSS الباردة لثلاثة يغسل إضافية، resuspending بيليه في خمسة ملليلتر من درجة حرارة الغرفة حل التدرج بعد الغسيل الماضي. دوامة الأنبوب لفترة وجيزة في سرعة منخفضة حتى يتم تجانس الحل قبل إضافة خمسة ملليلتر أخرى من درجة حرارة الغرفة التدرج إلى الأنبوب. الآن استخدام ماصة 10 ملليلتر لإضافة بلطف وببطء 10 ملليلتر من درجة حرارة الغرفة HBSS إلى أنبوب بطريقة قطرة الحكيمة للسماح بتشكيل التدرج واستخدام جهاز طرد مركزي دلو يتأرجح لعزل مجموعات الخلايا عن طريق الفصل الانحدار الكثافة.
في نهاية الطرد المركزي، استخدم ماصات 10 ملليلتر قبل الرطب مع HBSS الباردة لجمع خمسة إلى 10 ملليلتر من طبقة الجزر بين التدرج الكثافة وHBSS. نقل الجزر في أنبوب جديد 50 ملليلتر تحتوي على 20 ملليلتر من الجليد الطازج HBSS وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي دلو يتأرجح. pirate بعناية جميع ما عدا المليلترات الثلاث الأخيرة من عظمى دون إزعاج بيليه وغسل الجزر على الأقل ثلاث مرات أخرى مع 20 ملليلتر من HBSS الطازجة في غسل.
بعد الغسيل الأخير، استبدل المابير بأربعة ملليلترات من 37 درجة مئوية RMPI 1640 متوسطة ودوامة بلطف الأنبوب لطرد الكريه. صب على الفور الجزر في طبق بيتري 100 ملليمتر وغسل الأنبوب مع خمسة ملليلتر من 1640 1640 1640 جديدة متوسطة لجمع أي الجزر المتبقية تجمع الغسيل مع الجزر الأخرى. ثم استخدام مجهر تشريح و20 ميكرولتر ماصة تلميح لاختيار الجزر البني الكروية أو مستطيلة صحية مع سطح أملس من طبق بيتري لنقلها إلى طبق بيتري جديد يحتوي على 10 ملليلترات كاملة من دورة فاري أو 1640 المتوسطة.
عندما يتم جمع جميع الجزر الصغيرة، ضع الجزر في حاضنة معقمه عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في الهواء المرطب بين عشية وضحاها. الجزر صحية جيدة يبدو أن لها شكل دائري على نحو سلس في حين الجزر التالفة التالفة سيئة المعرض حواف خشنة. الأنسجة غير المهضومة exocrine شفافة في المظهر ويدل على شكل غير منتظم.
يمكن تأكيد التبليب والتوزيع السليمين لمينزيم الكولاجيناز P بواسطة تضخم الجزء المُبلِس من البنكرياس. الحضانة بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام منخفضة الجلوكوز يمكن أن رئيس الجزر لم مقايسة إفراز الأنسولين تحفيز الجلوكوز في اليوم التالي مما يسمح نظرة ثاقبة القدرة الإفرازية للأنسولين من الجزر.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً جديدًا لعزل الجزر باستخدام حقن الكولاجيناز لتحسين هضم الأنسجة وعائد الجزر. تبسيط عملية الفصل المتدرج، مما يسمح لعزل ناجح لـ 250-350 جزيرة عالية الجودة لكل فأر.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء
- تقنيات عزل الجزر
الخلفية
- عزل الجزر أمر بالغ الأهمية لأبحاث السكري.
- الطرق التقليدية قد تكون كثيفة العمالة ومكلفة.
- تقنيات محسنة يمكن أن تعزز عائد ووظائف الجزر.
- حقن الكولاجيناز يستهدف البنكرياس مباشرة.
هدف الدراسة
- تطوير بروتوكول عزل جزر أقل كثافة في العمالة.
- زيادة عائد الجزر الوظيفية من البنكرياس في الفئران.
- تبسيط الإجراء مع الحفاظ على جودة الجزر.
الطرق المستخدمة
- تدرج كثافة واحدة لتنقية الجزر.
- هضم enzimi للأنسجة خارجية الإفراز.
- الانتقاء اليدوي للجزر المعزولة.
- استخدام التقنيات الجراحية لكشف البنكرياس.
النتائج الرئيسية
- تحسين هضم الأنسجة يؤدي إلى عائد أعلى للجزر.
- البروتكول ينتج 250-350 جزيرة عالية الجودة لكل فأر.
- أقل كثافة في العمالة مقارنة بالطرق التقليدية.
- نهج فعال من حيث التكلفة لعزل الجزر.
الاستنتاجات
- البروتكول الجديد يحسن بشكل كبير من كفاءة عزل الجزر.
- التوصيل المباشر للإنزيم يعزز العائد والجودة الإجمالية.
- هذه الطريقة يمكن أن تسهل المزيد من البحث في مرض السكري.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Pancreatic islet isolation is a critical bottleneck in diabetes research, where low yield and labor-intensive protocols limit throughput for target validation and mechanistic studies. This protocol enhances predictive confidence by delivering collagenase P directly to the ampulla of Vater, enabling more complete enzymatic and mechanical digestion of exocrine tissue. The resulting increase in islet yield and quality supports reliable ex vivo insulin secretion assays, directly informing lead identification and preclinical model selection for diabetes therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of β-cell function and insulin secretion pathways through high-yield islet recovery.
- Operational Value: Reduces technical barriers to islet access, supporting consistent target validation across multiple mouse strains or disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces islets suitable for glucose-stimulated insulin secretion assays, providing quantitative readouts for compound screening.
- Operational Value: Simplifies purification via a single density gradient, improving assay standardization and reproducibility across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant systems by providing primary islets that maintain endocrine function for preclinical efficacy testing.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical work by delivering islets ready for functional validation in diabetic models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by supplying validated primary islets for downstream applications in lead identification and preclinical validation, particularly for diabetes-focused programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of insulin secretion mechanisms through access to functional islet populations.
- Screening: Delivers standardized islet preparations enabling reliable compound evaluation in secretion assays.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (e.g., insulin release) that help compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing disease-relevant islets for validation in diabetic models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation capability that reduces dependency on external suppliers and increases internal assay throughput.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in islet function.
- Operational Value: Standardization and scalability via simplified single-gradient purification and direct enzyme delivery.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions in diabetes programs by improving success rates of islet-based assays.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on reliable insulin secretion data from high-yield islet preparations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques for pancreatic duct cannulation and tissue handling.
- Depends on access to dissection microscopes, centrifuges, and temperature-controlled water baths for enzymatic digestion.
- Necessitates standardization of collagenase P concentration and incubation timing across operators to ensure consistent islet quality.
- Requires adaptation of gradient volumes and wash protocols when scaling to different mouse strains or ages.
- Practical limitations include potential islet damage from over-digestion, which can be mitigated by optimizing enzymatic exposure time as described in the protocol.
