متعدد التضخيم متحاور على أساس منهاج التشخيصية للكشف عن زكى وداء شيكونغونيا وحمى الضنك 1

الهدف العام من هذا الإجراء هو إثبات استخدام منصة تشخيص متعددة الإرسال في نقاط الرعاية لا تتطلب تحضيرا مكثفا للعينات وأجهزة باهظة الثمن وتستخدم في مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التشخيص في نقاط الرعاية مثل الكشف عن أهداف مختلفة في أنبوب تفاعل واحد. باستخدام التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة إلى جانب مجسات إزاحة خيوط خاصة بالهدف ، يمكن اكتشاف ثلاثة فيروسات مختلفة بكفاءة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم التضخيم متساوي الحرارة بدلا من تفاعل البوليميراز المتسلسل وتتطلب الحد الأدنى من تحضير العينة ويمكن تطبيقها على مجموعة من العينات السريرية. ابدأ بتقطيع أوراق Q-paper إلى مستطيلات صغيرة من ثلاثة ملليمترات × أربعة ملليمترات باستخدام لكمة ورقية. ثم استخدم مدقة صغيرة لسحق إناث البعوض الزاعجة المصرية التي يحتمل أن تكون مصابة بفيروس زيكا على كل ورقة.

ماصة 20 ميكرولتر من محلول الأمونيا المائي المولي على كل قطعة من الورق. بعد خمس دقائق ، اغسل كل ورقة ب 20 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 50٪ ، متبوعا ب 20 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز. جفف الورق بالهواء في خزانة السلامة الحيوية BSL-2 لمدة ساعة تقريبا.

بعد التجفيف ، استخدم الملقط لغمر كل ورقة بالكامل في 100 ميكرولتر من خليط تفاعل RT-LAMP واحتضانها عند 65 إلى 68 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. اقرأ وسجل التألق الناجم عن فيروس زيكا باستخدام صندوق مراقبة مطبوع ثلاثي الأبعاد مع مصدر ضوء LED ومرشح برتقالي أو أصفر. ابدأ بإضافة 90 ميكرولترا من محلول معالجة الجفاف 1.1 ضعفا إلى كل أنبوب تفاعل يحتوي على كواشف RT-LAMP المجففة بالتجميد وتذوب عن طريق الرج.

ثم تدور لفترة وجيزة عند 1000 مرة من الجاذبية. بعد الطرد المركزي ، أضف 10 ميكرولترات من عينة البول الممزوجة بالحمض النووي الريبي الفيروسي إلى أنابيب التفاعل واخلطها عن طريق سحب العينات. في حالة اختبار البعوض ، أضف مستطيلا من ورق Q يحتوي على جثث البعوض مع 10 ميكرولترات من الماء النقي بدلا من البول.

ضع الأنابيب المغلقة في كتلة حرارية محددة مسبقا عند 65 إلى 68 درجة مئوية واحتضانها لمدة 30 إلى 45 دقيقة. بعد الحضانة ، احتفظ بالأنابيب مغلقة لمنع تلوث المقايسات المستقبلية وضعها في صندوق المراقبة. قم بتشغيل المفتاح الموجود في الجزء الخلفي من صندوق المراقبة.

راقب العينة من خلال المرشح البرتقالي والتقط الصورة بواسطة كاميرا الهاتف المحمول التي يتم الاحتفاظ بها على مسافة حيث تملأ الصورة 80٪ من مجال الرؤية. بعد اكتمال المرئيات، قم بإيقاف تشغيل المفتاح. قم بتخزين الأنابيب محكمة الغلق في الظلام ويفضل أن يكون ذلك مع التبريد إذا كانت هناك حاجة إلى تصور لاحق.

في كل من الحالات المفردة والمتعددة ، تظهر منتجات RT-LAMP كحرف من السلسلة عند تشغيلها على هلام الاغاروز. أعطت عينات المراقبة السلبية التي تحتوي على الماء كعينة فقط نطاقات الاشعال نفسها بما في ذلك العنصر الضابط المستهدف غير المحدد حيث تم استخدام الحمض النووي الكلي المستخرج من أنثى بعوضة غير مصابة كنموذج. لوحظ التألق الأخضر لزيكا باستخدام مجسات كخمسة NT رئيسية مصنفة ب FAM.

يتم تعيين التألق الأصفر الأخضر الفاتح إلى Chikungunya حيث يتكون المسبار من خمسة NT رئيسية مسمى HEX. يتم استخدام مضان أحمر برتقالي لحمى الضنك -1 حيث يتكون مسبارها من خمسة NT رئيسية مسماة ب TAMRA. تم غمر ورقتين تحتويان على بعوض مباشرة في خليط RT-LAMP وبعد الحضانة عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، لوحظ تألق أخضر فاتح في وجود فيروس زيكا.

باستخدام تسعة أحجام من محلول الإماهة وحجم واحد من عينة البول ، يمكن إنشاء مضان أخضر مرئي في غضون 30 دقيقة ويمكن التقاط الصورة بواسطة أي كاميرا هاتف محمول. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التشخيص السريري لاستكشاف منصات نقاط الرعاية للكشف عن الفيروسات التي ينقلها البعوض في البول أو الدم أو اللعاب أو جثث البعوض. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام نظام تضخيم متساوي الحرارة ، في هذه الحالة يكون المصباح ، للكشف عن زيكا والفيروسات المفصلية الأخرى بطريقة متعددة الإرسال في مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية.