متعدد التضخيم متحاور على أساس منهاج التشخيصية للكشف عن زكى وداء شيكونغونيا وحمى الضنك 1
March 13th, 2018
الحالي متعدد التشخيص للكشف عن زيكا، الشيكونغونيا، وفيروسات حمى الضنك تتطلب إعداد نماذج معقدة ومكلفة للأجهزة، وهي صعبة الاستخدام في البيئات قليلة الموارد. علينا إظهار تشخيص التي يستخدمها التضخيم متحاور مع تحقيقات منقولة حبلا محددة الهدف لكشف والتفريق بين هذه الفيروسات مع حساسية عالية وخصوصية.
الهدف العام من هذا الإجراء هو إثبات استخدام منصة تشخيص متعددة الإرسال في نقاط الرعاية لا تتطلب تحضيرا مكثفا للعينات وأجهزة باهظة الثمن وتستخدم في مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التشخيص في نقاط الرعاية مثل الكشف عن أهداف مختلفة في أنبوب تفاعل واحد. باستخدام التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة إلى جانب مجسات إزاحة خيوط خاصة بالهدف ، يمكن اكتشاف ثلاثة فيروسات مختلفة بكفاءة.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم التضخيم متساوي الحرارة بدلا من تفاعل البوليميراز المتسلسل وتتطلب الحد الأدنى من تحضير العينة ويمكن تطبيقها على مجموعة من العينات السريرية. ابدأ بتقطيع أوراق Q-paper إلى مستطيلات صغيرة من ثلاثة ملليمترات × أربعة ملليمترات باستخدام لكمة ورقية. ثم استخدم مدقة صغيرة لسحق إناث البعوض الزاعجة المصرية التي يحتمل أن تكون مصابة بفيروس زيكا على كل ورقة.
ماصة 20 ميكرولتر من محلول الأمونيا المائي المولي على كل قطعة من الورق. بعد خمس دقائق ، اغسل كل ورقة ب 20 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 50٪ ، متبوعا ب 20 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز. جفف الورق بالهواء في خزانة السلامة الحيوية BSL-2 لمدة ساعة تقريبا.
بعد التجفيف ، استخدم الملقط لغمر كل ورقة بالكامل في 100 ميكرولتر من خليط تفاعل RT-LAMP واحتضانها عند 65 إلى 68 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. اقرأ وسجل التألق الناجم عن فيروس زيكا باستخدام صندوق مراقبة مطبوع ثلاثي الأبعاد مع مصدر ضوء LED ومرشح برتقالي أو أصفر. ابدأ بإضافة 90 ميكرولترا من محلول معالجة الجفاف 1.1 ضعفا إلى كل أنبوب تفاعل يحتوي على كواشف RT-LAMP المجففة بالتجميد وتذوب عن طريق الرج.
ثم تدور لفترة وجيزة عند 1000 مرة من الجاذبية. بعد الطرد المركزي ، أضف 10 ميكرولترات من عينة البول الممزوجة بالحمض النووي الريبي الفيروسي إلى أنابيب التفاعل واخلطها عن طريق سحب العينات. في حالة اختبار البعوض ، أضف مستطيلا من ورق Q يحتوي على جثث البعوض مع 10 ميكرولترات من الماء النقي بدلا من البول.
ضع الأنابيب المغلقة في كتلة حرارية محددة مسبقا عند 65 إلى 68 درجة مئوية واحتضانها لمدة 30 إلى 45 دقيقة. بعد الحضانة ، احتفظ بالأنابيب مغلقة لمنع تلوث المقايسات المستقبلية وضعها في صندوق المراقبة. قم بتشغيل المفتاح الموجود في الجزء الخلفي من صندوق المراقبة.
راقب العينة من خلال المرشح البرتقالي والتقط الصورة بواسطة كاميرا الهاتف المحمول التي يتم الاحتفاظ بها على مسافة حيث تملأ الصورة 80٪ من مجال الرؤية. بعد اكتمال المرئيات، قم بإيقاف تشغيل المفتاح. قم بتخزين الأنابيب محكمة الغلق في الظلام ويفضل أن يكون ذلك مع التبريد إذا كانت هناك حاجة إلى تصور لاحق.
في كل من الحالات المفردة والمتعددة ، تظهر منتجات RT-LAMP كحرف من السلسلة عند تشغيلها على هلام الاغاروز. أعطت عينات المراقبة السلبية التي تحتوي على الماء كعينة فقط نطاقات الاشعال نفسها بما في ذلك العنصر الضابط المستهدف غير المحدد حيث تم استخدام الحمض النووي الكلي المستخرج من أنثى بعوضة غير مصابة كنموذج. لوحظ التألق الأخضر لزيكا باستخدام مجسات كخمسة NT رئيسية مصنفة ب FAM.
يتم تعيين التألق الأصفر الأخضر الفاتح إلى Chikungunya حيث يتكون المسبار من خمسة NT رئيسية مسمى HEX. يتم استخدام مضان أحمر برتقالي لحمى الضنك -1 حيث يتكون مسبارها من خمسة NT رئيسية مسماة ب TAMRA. تم غمر ورقتين تحتويان على بعوض مباشرة في خليط RT-LAMP وبعد الحضانة عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، لوحظ تألق أخضر فاتح في وجود فيروس زيكا.
باستخدام تسعة أحجام من محلول الإماهة وحجم واحد من عينة البول ، يمكن إنشاء مضان أخضر مرئي في غضون 30 دقيقة ويمكن التقاط الصورة بواسطة أي كاميرا هاتف محمول. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التشخيص السريري لاستكشاف منصات نقاط الرعاية للكشف عن الفيروسات التي ينقلها البعوض في البول أو الدم أو اللعاب أو جثث البعوض. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام نظام تضخيم متساوي الحرارة ، في هذه الحالة يكون المصباح ، للكشف عن زيكا والفيروسات المفصلية الأخرى بطريقة متعددة الإرسال في مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تظهر هذه الدراسة منصة تشخيصية متعددة النقاط لاكتشاف فيروسات زيكا، الشيكونغونيا، وحمى الضنك. تعتمد الطريقة على التضخيم المتساوي الحرارة مع استخدام sondes ناقلة السلاسل المحددة للهدف، مما يسمح بالكشف الفعّال بحد أدنى من تحضير العينة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- التشخيص
- علم الفيروسات
- الفحص عند نقطة الرعاية
الخلفية
- التشخيصات الحالية لفيروسات زيكا، الشيكونغونيا، وحمى الضنك معقدة ومكلفة.
- هناك حاجة إلى طرق أبسط مناسبة للبيئات منخفضة الموارد.
- تعالج هذه الدراسة هذه التحديات من خلال تقديم نهج تشخيصي جديد.
- يوفر التضخيم المتساوي الحرارة مزايا على طرق PCR التقليدية.
غرض الدراسة
- لتطوير تشخيصي يتطلب الحد الأدنى من تحضير العينة.
- لتمكين كشف الفيروسات المتعددة في تفاعل واحد.
- لتحسين إمكانية الوصول إلى التشخيصات في البيئات محدودة الموارد.
الطرق المستخدمة
- تقنية تضخيم حلقة معتدلة الحرارة (LAMP).
- sondes ناقلة السلاسل المحددة للهدف لتمييز الفيروسات.
- استخدام عينات بيولوجية، بما في ذلك بعوضة الزاعجة المصرية المكسورة.
- تحضير بسيط للعينات باستخدام أوراق Q-paper.
النتائج الرئيسية
- نجحت الطريقة في كشف فيروسات زيكا، الشيكونغونيا، وحمى الضنك.
- تم تحقيق حساسية وخصوصية عالية في التشخيصات.
- تم تأكيد الحد الأدنى من تحضير العينة كميزة مهمة.
- يمكن تطبيق التقنية على مجموعة متنوعة من العينات السريرية.
الاستنتاجات
- تعد منصة التشخيص هذه أداة واعدة لاختبار نقطة الرعاية.
- تعالج القيود الحالية للتشخيصات المتعددة.
- قد تعزز التطبيقات المستقبلية كشف الفيروسات في بيئات متنوعة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Rapid discrimination of Zika, dengue, and chikungunya viruses is critical for guiding patient treatment and managing outbreak epidemiology. This multiplexed isothermal amplification platform enables point-of-care detection in clinical and environmental samples with minimal instrumentation and sample preparation. It supports timely decision-making in resource-limited settings where traditional RT-PCR is impractical.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of antiviral targets by confirming viral presence in complex biological matrices.
- Operational Value: Reduces dependency on centralized labs, accelerating hypothesis testing in discovery workflows.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible format for screening antiviral compounds across multiple arbovirus targets.
- Operational Value: Uses lyophilized reagents and ambient storage, supporting assay scalability and deployment in decentralized labs.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates longitudinal monitoring of viral load in preclinical models using urine, serum, or tissue samples.
- Operational Value: Eliminates RNA extraction steps, reducing variability and increasing throughput in efficacy studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows by enabling rapid, multiplexed viral detection that informs target engagement and mechanism-of-action studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven screening by confirming viral presence in cell culture or animal models.
- Screening: Delivers quantitative fluorescence readouts compatible with hit confirmation and dose-response profiling.
- Analytics: Generates multiplexed, three-color output enabling parallel assessment of antiviral efficacy against Zika, chikungunya, and dengue.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by allowing consistent viral quantification across sample types.
- Enterprise Reuse: Lyophilized format and minimal training requirements support reuse across geographic sites and project teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in antiviral screening by reducing false negatives from inadequate sample processing.
- Operational Value: Enables decentralized testing with minimal infrastructure, lowering operational burden on core laboratories.
- Strategic Value: Supports faster go/no-go decisions in antiviral programs by providing timely target modulation data.
- Portfolio Impact: Improves risk-adjusted prioritization of candidates through reliable, cross-virus efficacy profiling.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with isothermal amplification principles and fluorescence detection.
- Needs a heat block or incubator maintaining 65–68°C and a handheld observation device with orange filter.
- Demands standardized sample handling to ensure consistency across urine, serum, and mosquito matrices.
- Must account for environmental stability of lyophilized reagents during field deployment.
- Limited to endpoint detection; not suitable for real-time kinetic monitoring without modified instrumentation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:55
RT-LAMP for Detection of Zika-infected Mosquitoes Using Q-paper Technology
2:23
Testing Lyophilized RT-LAMP Reagents on Urine Samples Containing Zika
4:05
Results: Singleplex and Multiplex RT-LAMP for Detection of Zika, Chikungunya, and Dengue 1
5:40
Conclusion
