دراسة اتصالات مونوسينابتيك في المورفولوجية استخدام مقاومة تيدرودوتاكسين صوديوم قنوات

الهدف العام من هذه التقنية هو تحديد الوصلات أحادية المشبك من الناحية الفيزيولوجية الكهربية في ذبابة الفاكهة باستخدام قنوات الصوديوم المقاومة للذبابة السموم الرباعية. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها مباشرة ويمكن أن تكشف عن الطبيعة الكيميائية للمشابك العصبي. كما أنها مناسبة لدراسة الحجم أو النقل بالجملة.

بشكل عام ، في مقاطع الفيديو الجديدة على هذه الطريقة ، نكافح بسبب صعوبة التشريح. ومع ذلك ، بمجرد فهم الطريقة ، يمكن نقل المنطق بسهولة إلى أنظمة نموذجية أخرى مثل الفئران. بالنسبة للتسجيلات ، ضع ماصات رقعة للمقاومة بالقرب من سبعة ميغا أوم.

أيضا ، لديك محلول ملحي خارجي بدرجة حموضة 7.3 أو أقل تهوية بشكل مستمر مع كربوجين يحتوي على 95٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بالنسبة للموضوعات ، لديك مخزون ذبابة يعبر عن csChrimson ، ينتشر على الطعام الذي يحتوي على 0.2 ملليمولار من كل الشبكية عبر الشبكية. بالنسبة للتسجيلات ، حدد البالغين الذين تتراوح أعمارهم بين يوم واحد وثلاثة أيام.

قم بتحميلها في قارورة زجاجية ومألوقة وقم بتثبيتها باستخدام التعرض لمدة دقيقة واحدة لظروف الجليد الباردة. بعد ذلك ، قم بخفض مستوى الضوء على نطاق التشريح والملقط الخشن لتحميل ذبابة مخدرة في غرفة التسجيل المخصصة. قم بتأمين الذبابة في الغرفة من خلال إحاطتها بالشمع أو الإيبوكسي القابل للعلاج بالأشعة فوق البنفسجية.

ضعه على الجانب الظهري لأعلى مع الرقاقة في منتصف الصدر تقريبا. مفتاح الحصول على تحضير رائع هو قطع الثقب في الرقاقة ليكون بالحجم المناسب تماما ، بحيث لا يتم ضغط الذبابة أو قدرتها على السقوط. قم بإضاءة المستحضر بأضواء الألياف الضوئية من كلا الجانبين واحتفظ بها معتمة قدر الإمكان.

بعد ذلك ، قم بتغطية المستحضر بأربع إلى ست قطرات من محلول ملحي التسجيل. بعد ذلك ، شحذ سلك التنغستن أو خيوط التشريح. ضع حوالي 20 فولت من تيار التيار المتردد على محلول مشبع بنترات البوتاسيوم واغمس طرف السلك بشكل متكرر بسرعة كبيرة في المحلول.

بعد 20 انخفاضا ، سيكون الطرف حادا. الآن ، اضبط الأضواء لتوفير رؤية كافية لاستخدام السلك الحاد لفضح الدماغ عن طريق إزالة البشرة ، متبوعة بالقصبة الهوائية والأجسام الدهنية. للوصول إلى فصوص الهوائيات ، استخدم سلك تنجستن مثني لثني الهوائي برفق تحت درع الرقائق.

ثم استخدم ملقطا حادا لتمزيق الغلاف الدبقي الذي يغطي منطقة الاهتمام برفق. الآن انقل المستحضر إلى جهاز الفيزيولوجيا الكهربية لعمل التسجيلات. في الحفارة ، ابدأ على الفور في حشو المستحضر بمحلول ملحي مليء بالكربوجين.

استخدم خزان محلول ملحي يتغذى بالجاذبية يوضع فوق مرحلة المجهر. لجمع النفايات المالحة ، استخدم خط تفريغ وقارورة سعة 2 لتر. بعد ذلك، قم بتحميل ماصة التصحيح ب 4 ميكرولتر من محلول التسجيل الداخلي وقم بتوصيل الماصة بمعالج دقيق.

بعد ذلك ، قم بتصفير إزاحة مكبر الصوت واضبط مكبر الصوت لتقديم نبضات الاختبار. بعد ذلك ، اضبط الإضاءة المائلة بالأشعة تحت الحمراء من أجل الحصول على رؤية واضحة للدماغ. الآن ، أثناء الضغط الإيجابي على الماصة ، اقترب من الخلية باستخدام الماصة.

عند التلامس مع الخلية ، حرر الضغط الإيجابي لإغلاق الماصة بالغشاء. بعد ذلك ، اضبط إمكانات الاحتفاظ بالغشاء على 60 مللي فولت تحت الصفر. ويجب أن تشكل الماصة ختما جيجا أوم بغشاء الخلية.

يجب أن ينخفض تيار التثبيت إلى مستوى بيكوأمبير فرعي منخفض. للحصول على أختام جيجا أوم ثابتة، تأكد من الحفاظ على نظافة الماصة عن طريق الحفاظ على الضغط الإيجابي وتجنب اصطدام الأنسجة أو الاقتراب من خلاياك. للمتابعة ، اضبط مكبر الصوت لتوصيل نبضات اختبار من سالب 50 إلى 60 مللي فولت تحت الصفر.

ستكشف نبضات الاختبار عن عابر سعوي كبير يمثل التيار اللازم لشحن الماصة التصحيحية. لإزالة الزوال السعوي ، اضبط مقابض تعويض السعة على مكبر الصوت. الآن ، قم بتطبيق نبضات قصيرة من الضغط السلبي لتمزيق غشاء الخلية والحصول على تكوين الخلية بالكامل.

الزيادة الكبيرة في العابرة السعوية إلى النجاح. يجب أيضا ملاحظة زيادة طفيفة في تيار الاحتجاز. ثم اضبط مكبر الصوت على وضع المشبك الحالي.

واضبط إمكانات الخلية إلى ما بين سالب 50 و60 مللي فولت تحت الصفر. أثناء التحضير، قم بتكوين نظام الحصول على البيانات كما هو موضح في بروتوكول التكنولوجيا. يتطلب النظام مصباح LED أحمر عالي الطاقة موضوعا أسفل المستحضر ، ويتم وضعه لإضاءة الذبابة بسرعة 0.238 مللي واط لكل ملليمتر مربع.

الآن ، قم بتنشيط الخلايا العصبية قبل المشبكية بصريا ، باستخدام الضوء الأحمر النبضي في تعبير csChrimson. يمكن أيضا استخدام طرق أخرى. قبل تطبيق السموم الرباعية ، يجب أن يكون الاتصال المشبكي مرئيا استجابة لنبضة ضوئية تبلغ 40 مللي ثانية.

عدم وجود استجابة يعني أن الاتصال غير مرجح. يمكن تعديل إمكانية الاحتفاظ للتأكيد على الوصلات المثيرة أو المثبطة ، وفقا لذلك. بمجرد التحقق من الاتصال ، قم بإعداد وفرة المحلول الملحي لإعادة التدوير في المحلول الملحي.

اضبط المضخة بحيث يظل مستوى المحلول الملحي في الحمام مستقرا. بعد ذلك ، أضف ما يكفي من السموم الرباعية إلى النظام للحصول على تركيز نهائي من ميكرومولار واحد. هذا يجب أن يوقف النشاط المتصاعد للخلايا العصبية المرقعة.

إذا لم يكن الأمر كذلك ، أضف المزيد من السموم الرباعية إلى النظام. الآن ، قم بتطبيق نبضات قصيرة من الضوء الأحمر لتنشيط ما يحتمل أن يكون اتصالا أحادي المشبكي. بعد ذلك ، تابع إضافة مضادات دوائية إلى المحلول الملحي المعاد تدويره لاختبار الطبيعة الكيميائية للوصلات المتشابكة.

التعبير المعدل وراثيا للسموم الرباعية في قناة الصوديوم الحساسة ينقذ الاستثارة في الخلايا العصبية وينتج عنه إمكانات هضبة كبيرة. تستجيب الخلايا العصبية الداخلية في فص الهوائي للروائح. ومع ذلك ، لا يمكن حل التيارات المثيرة بعد التشابك بسهولة في سوما.

إذن ، هل تنشأ الاستجابات مباشرة من مدخلات الخلايا العصبية لمستقبلات حاسة الشم؟ يكشف استخدام tERPs أن الخلايا العصبية المستقبلة الشمية تقوم باتصالات مباشرة مع الخلايا العصبية الداخلية المحلية. يؤدي تحفيز الخلايا العصبية السيروتونية في الفص الهوائي إلى مزيج من الإثارة والتثبيط في الخلايا العصبية الداخلية المحلية.

منع تطبيق methysergide ، وهو مضاد واسع لمستقبلات 5HT ، فرط الاستقطاب البطيء ، ولكن لم يكن له أي تأثير على إزالة الاستقطاب ، بينما يمنع الميكاميلامين إزالة الاستقطاب السريع. هذا يشير إلى أن التحفيز اتروبين. تم استخدام tERPs لحل انتقال الحجم خارج المشبكي الذي يحدث إما مع GABA أو المعدلات العصبية.

في أحد الأمثلة ، لم يثبط تطبيق السموم الرباعية إشارة مثبطة في الخلايا العصبية الداخلية المحلية. تم حظر هذا التثبيط باستخدام مضاد السيروتونين ، methysergide ، مما يشير إلى إشارة مباشرة من خلية عصبية معينة من السيروتونين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على تسجيلات خلوية كاملة من الخلايا العصبية ذبابة الفاكهة وتقييم موصليتها باستخدام tERPs.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التحلي بالصبر وممارسة التشريح الصعب بشكل متكرر. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ساعة تقريبا إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل علم الأدوية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل طبيعة المشبك الكيميائي.

لا تنس أن العمل مع السموم الرباعية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل ارتداء القفازات والعمل بكميات صغيرة ، أثناء تنفيذ هذه الإجراءات.