ريسبيروميتري عالية الدقة لقياس الوظيفة المتقدرية سليمة من خلايا بيتا حضور المركبات الطبيعية
يناير 23, 2018
والهدف من هذا البروتوكول لقياس تأثير التغييرات الجلوكوز بوساطة للتنفس المتقدرية حضور المركبات الطبيعية في خلايا بيتا سليمة 832/13 باستخدام ريسبيروميتري ذات الدقة العالية.
الهدف العام من هذا النهج هو التقييم المباشر لوظيفة الجهاز التنفسي لخلايا بيتا البنكرياس ، في ظل ظروف تحفيز الأنسولين. ويمكن أيضا استخدام هذا لمراقبة تأثير المركبات المختلفة على وظيفة الجهاز التنفسي لخلايا بيتا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال فسيولوجيا خلايا بيتا البنكرياس ، مثل ما إذا كان مركب معين يؤثر على وظيفة خلايا بيتا البنكرياس من خلال التغيرات في التنفس.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها لتقييم وظيفة الجهاز التنفسي مباشرة في خلايا بيتا البنكرياس ، في ظل الظروف التحفيزية القاعدية والأنسولين. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات تحضير الخلية واستخدام الماكينة ، نظرا للدقة المطلوبة في تحضير الخلية وقياس التنفس. للبدء ، استزراع خلايا بيتا 832/13 المشتقة من INS-1 في RPMI 1640 المكملة.
قم بإزالة الخلايا من قارورة T75 ، عن طريق إضافة ملليلترين من 0.25٪ تريبسين ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بتحييد التربسين عن طريق إضافة ثمانية ملليلتر من وسائط RPMI 1640 الكاملة. قم بتخفيف 100 ميكرولتر من حجم الخلية في 900 ميكرولتر من PBS ، واحسب الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
ثم قم بوضع الخلايا بكثافة مليون خلية لكل مليلتر ، في طبق 10 سم. استزراع الخلايا في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، قبل البدء في تجارب التنفس. قم بتغيير الوسائط بعد 24 ساعة من طلاء وزراعة الخلايا 832/13 في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد ذلك ، عالج الخلايا بالتحكم في السيارة أو المشتق من الكاكاو ، مونومر epicatechin ، للحصول على تركيز نهائي يبلغ 100 نانو مولار. يجب متابعة إضافة العلاج بالثقافة لمدة 24 ساعة إضافية في حاضنة مرطبة، عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، اغسل الخلايا في مخزن مؤقت لمقايسة إفراز الجلوكوز المنخفض 1x ، أو SAB لمدة خمس دقائق.
استنشق المخزن المؤقت واحتضان الخلايا في 1x منخفض الجلوكوز SAB لمدة ثلاث ساعات ، مع تغيير المخزن المؤقت كل ساعة. بعد الحضانة ، قم بإزالة الخلايا من الطبق باستخدام مليلتر واحد من 0.25٪ تريبسين. امزج الخلايا الموجودة في التربسين من الطبق المعالج بالتحكم في السيارة ، مع أربعة ملليلتر من SAB في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا.
وبالمثل ، امزج الطبق المعالج بمركب الاهتمام ، مع مخزن مؤقت. قم بتخفيف 100 ميكرولتر من حجم الخلية في 900 ميكرولتر من PBS ، واحسب الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. قم بتخفيف 100 ميكرولتر من حجم الخلية في 900 ميكرولتر من PBS ، واحسب الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
تظهرالبيانات أن تركيز مليون خلية لكل مليلتر هو الأكثر فعالية. بعد تحضير مقياس التنفس عالي الدقة كما هو مفصل في بروتوكول النص ، أضف 2.4 مل من 1x محلول SAB منخفض الجلوكوز إلى كل غرفة أوكسجيراف. حرك المخزن المؤقت باستمرار باستخدام قضبان التحريك المغناطيسية في الغرفة عند 750 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية ، مع فاصل تسجيل بيانات يبلغ 2.0 ثانية.
للقيام بذلك ، حدد الزر F7 ، وافتح علامة التبويب المسماة ، الأنظمة. ادفع المكابسات بالكامل ثم اسحبها إلى إعداد تهوية مفتاح الربط. دع الماكينة تتوازن لمدة ساعة واحدة على الأقل حتى يتم الحصول على تدفق أكسجين مستقر.
بعد ذلك ، اضبط الجهاز على 37 درجة مئوية طوال مدة التجربة. اضغط على الزر F7 وافتح علامة التبويب المسماة Oxygen O2 لضبط جهد الاستقطاب على 800 مللي فولت بكسب اثنين. قم بموازنة تركيز الأكسجين في المخزن المؤقت SAB لمدة 30 دقيقة على الأقل ، حتى يستقر التغيير في تركيز الأكسجين.
بعد ذلك ، حدد منطقة يكون فيها تغيير تركيز الأكسجين مستقرا لإنشاء قياس الخلفية للتغيير في تركيز الأكسجين ، عن طريق الضغط على مفتاح shift ، والنقر بزر الماوس الأيسر على الماوس وسحب الماوس عبر المنطقة المحددة. انقر فوق الحرف المرتبط بالمنطقة المحددة وقم بتغييره إلى R1 لكل تتبع يتوافق مع كل من الغرفتين. انقر نقرا مزدوجا فوق مربع معايرة O2 في الزوايا السفلية اليسرى واليمنى من الشاشة.
انقر فوق الزر تحديد علامة لمعايرة الهواء ك R1، ثم حدد معايرة ونسخ إلى الحافظة لكلتا الحجرتين. بعد ذلك ، قم بتحميل 2.4 مل من العينة في كل غرفة ، وتحميل غرفة واحدة بالخلايا المعالجة بمركبة التحكم وغرفة واحدة بالخلايا المعالجة المركبة في 1x منخفض الجلوكوز SAB. ادفع المكبس بالكامل واستنشق الحجم المتبقي.
حرك الخلايا باستمرار طوال التجربة عند 750 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لجميع الخطوات اللاحقة. قم بعمل علامة بالنقر فوق F4 وتسمية العلامة كخلايا عند تحميل العينات. قم بقياس العينات لمدة 30 دقيقة.
بعد تثبيت الإشارة ، حدد منطقة التغير في تركيز الأكسجين المقابلة لظروف الجلوكوز المنخفضة. بعد ذلك ، أضف 12.5 ميكرولتر من محلول الجلوكوز المعقم بنسبة 45٪ في كل غرفة من خلال منفذ تحميل التيتانيوم باستخدام حقنة. ضع علامة تحمل علامة الجلوكوز عند إضافة العلاج.
دع الإشارة تستقر وتسجل التنفس الخلوي حتى يتم تحقيق تدفق أكسجين مستقر. في هذه المرحلة ، حدد منطقة التغير في تركيز الأكسجين لتمثيل قراءة الجلوكوز 16.7 مللي مولار ، والتي تتوافق مع الظروف التنشيطية. بعد الوصول إلى استقرار الإشارة ، أضف ميكرولتر واحد من خمسة مللي مولار Oligomycin A في كل غرفة من خلال منفذ التحميل.
ضع علامة تحمل علامة OligoA عند إضافة العلاج. دع الإشارة تستقر وتسجل التنفس الخلوي حتى يتم تحقيق تدفق أكسجين مستقر. بمجرد تحقيق تدفق الأكسجين المستقر ، حدد هذه المنطقة من المنحنى.
يثبط أوليغومايسين أ سينسيز ATP ، وبالتالي فإن تدفق الأكسجين الوحيد الذي يحدث هو عن طريق تسرب الإلكترونات وليس الفسفرة المؤكسدة. بعد ذلك ، أضف مليمولار FCCP بزيادات ميكرولتر واحدة حتى يتم تحديد الحد الأقصى لمعدل التنفس. هذا يمثل أقصى قدر من التنفس غير المقترن.
ما بين ثلاثة وأربعة ميكرولترات من FCCP ، يكفي للحث على أقصى قدر من التنفس غير المقترن لخلايا بيتا 832/13 المشتقة من INS-1. ضع علامة تحمل علامة FCCP عند إضافة العلاج. دع الإشارة تستقر وتسجل التنفس الخلوي حتى يتم تحقيق تدفق أكسجين مستقر.
ثم حدد هذه المنطقة من المنحنى. FCCP هو عامل فصل ، مما يسمح بقياس التنفس غير المقترن. بعد الوصول إلى استقرار الإشارة ، أضف ميكرولتر واحد من خمسة مللي مولار Antimycin A إلى كل غرفة من خلال منفذ التحميل.
ضع علامة تحمل علامة AntiA عند إضافة العلاج وكرر إجراء اختيار المنحنى. أدخل عدد الخلايا لكل مليلتر مستخدم في الفحص ، عن طريق الضغط على الزر F3 لبرنامج تحليل مقياس التنفس. قم بتغيير الوحدات إلى خلايا لكل مليلتر ، وأدخل التركيز الخلوي وقم بتغيير الوسيط إلى SAB.
حدد قراءات الخلفية لتطبيع البيانات عن طريق تحديد نموذج معايرة الأكسجين وإدخاله فيه. قم بإجراء اختيارات للقراءات من 2.5 مللي مولار جلوكوز ، 16.7 مللي مولار جلوكوز ، أوليغومايسين أ ، FCCP ، وأنتيمايسين أ.ضمن برنامج تحليل مقياس التنفس ، أدخل تركيز البروتين وحدد متوسط القيم المناسبة لكل علاج أثناء قياس التنفس. ثم انقر فوق F2 وانقر فوق وظيفة النسخ إلى الحافظة.
يؤدي هذا إلى تصدير البيانات لاستخدامها في برامج التحليل الأخرى. استخدم القيم السالبة لميل O2 للحسابات. قم بتجميع البيانات لثلاثة إلى خمسة أشواط مستقلة من الضوابط المعالجة بالمركبات والخلايا المعالجة بالمركبات الطبيعية لتحديد التأثير على التنفس الخلوي السليم لخلايا بيتا 832/13 المشتقة من INS-1.
تظهرخلايا بيتا 832/13 السليمة المشتقة من INS-1 زيادة في استخدام الأكسجين الناجم عن الجلوكوز. من الأهمية بمكان استخدام العدد المناسب من الخلايا. تظهر النتائج التي تم جمعها في هذه التجربة أن مليون خلية لكل مليلتر هي الكمية المثلى.
لاتظهر خلايا بيتا 832/13 المشتقة من INS-1 المعالجة بالكركمين أي تغيير في التنفس العام. على العكس من ذلك ، فإن خلايا بيتا 832/13 المشتقة من INS-1 المعالجة بالكاكاو الأحادي قد زادت من التنفس عند 2.5 ملليمولار جلوكوز و 16.7 ملليمولار جلوكوز. لوحظ أيضا زيادة التنفس أثناء حالة التسرب وهي الحالة التنفسية القاعدية غير الفسفرية ، بالإضافة إلى تنفس نظام نقل الإلكترون أو حالة ETS ، وهي أقصى تنفس.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التقييم المباشر لوظيفة الجهاز التنفسي لخلايا بيتا البنكرياس في ظل ظروف تحفيز الأنسولين. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون خمس ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر معالجة الخلايا مسبقا بمحلول SAB منخفض الجلوكوز ، والحصول على عدد دقيق للخلايا للمقايس.
بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة للحصول على الكمية المناسبة من الخلايا للقياسات الفعالة. مع وجود عدد كبير جدا من الخلايا ، يصعب تقييم الإشارة ومع وجود عدد قليل جدا ، لا تكون الإشارة عالية بما يكفي للقياس باستمرار. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج أو تشخيص مرض السكري وأي حالة تتأثر بالتغيرات في وظيفة خلايا بيتا البنكرياس ، لأن تنفس الميتوكوندريا هو عنصر حاسم في كيفية عمل إفراز الأنسولين.
بعد هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل ، ما هو تأثير هذه المركبات على إفراز الأنسولين؟ على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لوظيفة خلايا بيتا ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى ، مثل العضلات والكبد والدهون وغيرها من تحليلات الجهاز التنفسي للميتوكوندريا.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يهدف هذا البروتوكول إلى تقييم الوظيفة التنفسية لخلايا بيتا البنكرياس، خاصةً تحت ظروف تحفيز الأنسولين. يقيّم تأثير مركبات مختلفة على التنفس الميتوكوندري في خلايا بيتا 832/13 السليمة باستخدام التنفس عالي الدقة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- فيزيولوجيا الخلية
- البحث الأيضي
الخلفية
- فهم وظيفة خلايا بيتا البنكرياس أمر حاسم لأبحاث السكري.
- الوظيفة التنفسية هي مؤشر رئيسي لصحة الخلية والاستقلاب.
- المركبات الطبيعية قد تؤثر على التنفس ووظيفة خلايا بيتا.
- تسمح تقنية التنفس عالي الدقة بقياس دقيق لنشاط الميتوكوندريا.
هدف الدراسة
- قياس التغيرات في التنفس الميتوكوندري الناجم عن الجلوكوز.
- تقييم تأثيرات المركبات الطبيعية على وظيفة خلايا بيتا.
- توفير رؤى حول فيزيولوجيا خلايا بيتا البنكرياس.
الطرق المستخدمة
- زراعة خلايا بيتا 832/13 المشتقة من INS-1 في وسط RPMI 1640 مضاف إليه مواد غذائية.
- استخدام التنفس عالي الدقة لقياس التنفس.
- تقييم الوظيفة التنفسية تحت ظروف أساسية وظروف التحفيز بالأنسولين.
- عروض مرئية لمساعدة في تحضير الخلايا واستخدام الآلة.
النتائج الرئيسية
- تقييم مباشر للوظيفة التنفسية في خلايا بيتا البنكرياس.
- ملاحظة تأثير المركبات على التنفس.
- رؤى حول الاستجابات الفسيولوجية لخلايا بيتا للجلوكوز.
- تحديد العوامل الرئيسية التي تؤثر على استقلاب خلايا بيتا.
الاستنتاجات
- هذه الطريقة حاسمة لفهم فيزيولوجيا خلايا بيتا.
- توفر تقنية التنفس عالي الدقة بيانات قيمة عن وظيفة الميتوكوندريا.
- يمكن للبحوث المستقبلية استكشاف الإمكانات العلاجية للمركبات الطبيعية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Assessing mitochondrial respiration in intact pancreatic beta cells provides critical mechanistic insights into glucose-stimulated insulin secretion, a core pathway in diabetes pathophysiology. This approach enables de-risking of natural compound effects on beta cell bioenergetics, supporting target validation and lead identification in metabolic disease programs. By quantifying oxygen flux under defined glucose and compound conditions, the method delivers predictive confidence for prioritizing modulators of beta cell function in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking compound exposure to changes in mitochondrial respiration, a key driver of insulin secretion.
- Operational Value: Enables functional validation of targets in a physiologically relevant, intact cell system under basal and stimulatory glucose conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that enhance or inhibit basal, leak, or maximal respiration states in beta cells.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative oxygen consumption data that can be normalized to cell count for reproducible compound screening.
- <Scalability: Supports testing of natural compounds like epicatechin and curcumin across glucose concentrations to define structure-activity relationships.
- Platform Reuse: Establishes a respirometry-based workflow applicable to other mitochondrial-dependent systems such as hepatocytes or myocytes.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects mitochondrial function to insulin secretion, offering a translational biomarker for beta cell health in diabetes models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether compounds affect beta cell function via respiratory changes, reducing ambiguity in mechanism of action.
- <Preclinical Continuity: Provides mechanistic readouts that can inform follow-up assays like glucose-stimulated insulin secretion for integrated functional validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, particularly for metabolic disease programs focused on beta cell preservation or enhancement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring how compounds alter mitochondrial respiration in intact beta cells under insulin-stimulatory conditions.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative oxygen flux outputs that enable comparison of compound effects across glucose levels.
- Analytics: Provides normalized respiration metrics (basal, leak, ETS states) that allow teams to rank compounds by bioenergetic impact.
- Translational Research: Links mitochondrial measurements to functional outcomes like insulin secretion, enabling risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized respirometry platform for evaluating mitochondrial modulators across multiple cell types and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving mechanistic ambiguity around compound effects on beta cell respiration.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantification of mitochondrial function using high-resolution respirometry with defined calibration and normalization steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, mechanism-linked respirometry data that reduces late-stage failure risk in metabolic programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on basal, ATP-linked, and maximal respiration in beta cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture, trypsinization, and hemocytometer-based counting to ensure consistent cell density (1x10⁶ cells/mL).
- Dependent on high-resolution respirometer instrumentation with precise temperature, stir speed, and oxygen calibration controls.
- Necessitates cross-team standardization of SAB buffer preparation, glucose titration, and inhibitor injection protocols (Oligomycin A, FCCP, Antimycin A).
- Involves adaptation considerations when transferring the assay to other cell types, including optimization of cell density and substrate/inhibitor concentrations.
- Limited by the need for meticulous cell preparation and machine equilibration, as signal stability is critical for accurate respiration measurement.
