تقييم الدالة حويصلة خارج الخلية أثناء الإصابة بالملاريا

في هذا العمل، ويصف لنا بروتوكولات التحقيق في دور حويصلات خارج الخلية (EVs) صدر عن الكريات الحمراء المنجلية المصابة. على وجه الخصوص، نحن نركز على تفاعلات المركبات الكهربائية مع خلايا بطانية.

الهدف العام من هذا الإجراء هو التحقيق في وظيفة الحويصلات خارج الخلية التي يطلقها طفيلي الملاريا خلايا الدم الحمراء المصابة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في حقول الملاريا ، مثل كيفية تنظيم الطفيليات للتواصل بين الطفيليات والمضيف. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي تصور المراجحة الحويصلية بواسطة الخلايا indoterot قيد دراسة الوظيفة التنظيمية للحمض النووي الريبي الحويصلي بواسطة الخلايا indoterot.

سيظهر الإجراء ميا ألونديز وسمارتين باجو وبايو باباتوندي ، وجميعهم طلاب دراسات عليا من مختبري. في أنبوب الطرد المركزي الصغير ، أضف 100 ميكروغرام من الحويصلات خارج الخلية ومليلتر واحد من محلول ملحي مخزن بالفوسفات. ثم الطرد المركزي الحويصلات خارج الخلية بسرعة قصوى تبلغ 20 ، 000 مرة جم لمدة سبع دقائق لتشكيل حبيبات.

بمجرد انتهاء الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات. ثم قم بإذابة حبيبات الحويصلة خارج الخلية في 100 ميكرولتر من C.To المنظار لضمان خلط ماصة كاملة عدة مرات. بعد ذلك ، في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد ، أضف أربعة ميكرولترات من محلول صبغة الإيثانولي PKH67 إلى 100 ميكرولتر من dilmant C. ثم قم بدوامة الخليط جيدا.

قم بإعداد محلول الصبغة 40 ميكرومولار 2XPKH67 قبل عملية التلوين مباشرة. ثم امزج بسرعة 100 ميكرولتر من معلقين حويصليين خارج الخلية مع حجم متساو من محلول الصبغة الإيثانولي PKH67. ثم ماصة الخليط 10 مرات لضمان الخلط المناسب.

بعد الخلط الكامل ، احتضان محلول الصبغة الإيثانولي الحويصلي خارج الخلية و PKH67 لمدة خمس دقائق بعيدا عن الضوء. أثناء الحضانة ، استمر في دوامة الخليط ثلاث إلى أربع مرات. لإيقاف تفاعل التلوين ، أضف 200 ميكرولتر من المصل إلى الخليط واحتضنه لمدة دقيقة حتى تلتصق الصبغة الزائدة.

بعد ذلك ، اغسل الحويصلات خارج الخلية بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات ثلاث مرات. بعد الغسيل ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 20 ، 000 مرة جم لمدة خمس دقائق. ثم قم بإذابة الحبيبات الحويصلية خارج الخلية في 100 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات للوصول إلى تركيز نهائي قدره ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر.

انقل الخلايا البطانية في ملليلتر واحد من وسط نمو الخلايا البطانية الكامل إلى زلة غطاء مطلية بالبولي إليثين. اسمح للخلايا بالنمو أحادي الطبقة على زلة الغطاء. بعد تشكيل الطبقة الأحادية ، قم بإزالة الوسط بعناية وأضف ملليلترا واحدا من الوسط الطازج لغسل الخلايا مرتين.

ثم أضف 50 ميكروغراما من الحويصلات خارج الخلية الملطخة PKH67 إلى زلة الغطاء واحتضانها لمدة أربع ساعات. بعد الحضانة ، استنشق الوسط. لإزالة جميع الحويصلات خارج الخلية غير المرتبطة ، اغسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات ثلاث مرات.

يجب توخي الحذر الشديد أثناء التلاعب بالتلوين من زلات الغطاء باستخدام ملقط دقيق لتجنب فقدان الخلايا وكسر انزلاق الغطاء. بعد الغسيل ، استخدم ثلاثة بالمائة من محلول بارافورمالدهيد في محلول ملحي مخزن بالفوسفات لإصلاح الخلايا لمدة 15 دقيقة. مرة أخرى ، اغسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات ثلاث مرات وأضف 250 ميكرولتر من 0.1 في المائة من التريتان × 100 في محلول ملحي مخزن بالفوسفات لاختراق الخلايا واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، اغسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات ثلاث مرات وأضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للخلايا ثم احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاثين دقيقة لمنع الارتباط غير المحدد. بعد الحظر ، اغسل الخلايا مرة واحدة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات.

ثم قم بتخفيف خمسة ميكرولترات من محلول مخزون الفالودين في 200 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات مع واحد بالمائة من ألبومين مصل الأبقار لتحضير محلول التلوين لكل زلة غطاء. ثم أضف 200 ميكرولتر من محلول التلوين على زلة الغطاء واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. بمجرد انتهاء الحضانة ، اغسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات ثلاث مرات.

ثم استخدم التركيز النهائي البالغ ميكروغرامين لكل مليلتر من 3342 المعقوف في 200 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات لمواجهة تلطيخ الحمض النووي لمدة 30 ثانية. بعد التلوين ، أضف 400 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات لغسل زلة الغطاء مرتين. ثم ارفع زلة الغطاء بعناية بمساعدة الملقط واقلبها على الجزء العلوي من قطرة من وسائط التثبيت المضادة للبهتان على شريحة زجاجية.

استخدمي منديلا ورقيا لإزالة أي وسائط زائدة برفق ثم أغلق المحيط بطلاء الأظافر. يجب أيضا توخي الحذر الشديد لعدم تعريض الخلايا للكثير من الصبغة أثناء الفحص المجهري لتجنب تبيض الخلايا. في إدراج 24 مزرعة أنسجة بئر بحجم صب 0.4 ميكرومولار ، الخلايا البطانية للبذور.

ثم دع الخلايا تنمو في المزرعة لمدة خمسة أيام دون إزعاجها لتشكيل طبقة أحادية متمايزة. استمر في تغيير الوسيط كل يومين. بمجرد تشكيل الطبقة الأحادية ، قم بزرع 50 ميكروغراما في مليلتر واحد من الحويصلات خارج الخلية في الغرفة العلوية.

ثم أضف 20 ملليغرام لكل مليلتر من روتومين ديكستران إلى البئر العلوي واحتضن عند 37 درجة مئوية مع خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. راقب هجرة ديكستران الفلورسنت إلى قاع البئر عن طريق قياس مهمة الفلور من 40 ميكرولتر من الغطاء المتوسط. ثم قم ببرمجة الطول الموجي للإثارة عند 544 نانومتر والطول الموجي للانبعاث عند 590 نانومتر لقارئ الألواح الدقيقة متعدد الملصقات.

استخدم مقياس كثافة الدم لحساب عدد الخلايا. ثم أعد تعليق الخلايا البطانية في وسط ثقافة بطانة كاملة وزرع الخلايا في صفيحة بئر 96 في 100 ميكرولتر من وسط نمو الخلايا البطانية. لتحقيق تركيز من 0.1 إلى عشرة ميكروغرام لكل مليلتر ، أضف 100 ميكرولتر من الوسط المحتوي على المضادات الحيوية.

راقب صلاحية الخلايا كل يومين باستخدام هدف 20 مرة تحت المجهر الضوئي. استمر في زراعة الخلايا لمدة 10 إلى 14 يوما أخرى واستبدل الوسط المحتوي على المضادات الحيوية كل يومين إلى ثلاثة أيام ، اعتمادا على نمو الخلايا. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولتر من كاشف MTS في كل بئر واخلط الكاشف.

احتضان صفيحة البئر 96 عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. بعد أربع ساعات ، قم بتحريك اللوحة لفترة وجيزة على شاكر. ثم اقرأ المواد الماصة للخلايا المعالجة وغير المعالجة باستخدام قارئ الألواح عند 490 نانومتر.

قبل يوم واحد من نقل الفيروسات ، قم بزرع الخلايا البطانية في مليلتر واحد من الوسط الكامل. انتظر حتى تصل الخلايا إلى 50 إلى 80 في المائة من التقاء نقل الفيروسات العدسية قبل فتح الأنبوب ، قم بتدوير معلق الفيروس عند 200 مرة جم لمدة 30 ثانية لتجنب الانسكاب. ثم أضف بروميد هيكسيديمثرين إلى الخلايا للتكيف مع التركيز النهائي البالغ ثمانية ميكروغرام لكل مليلتر وقم بتدوير اللوحة برفق.

أضف الفيروس إلى الخلايا وقم بتدوير اللوحة برفق مرة أخرى لمدة 30 ثانية لضمان الخلط المناسب. لزيادة كفاءة نقل الفيروسات ، قم بالطرد المركزي لخليط الخلية الفيروسية عند 300 مرة جم لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم احتضان الخليط الفيروسي الخلوي عند 37 درجة مئوية طوال الليل.

في اليوم التالي ، تخلص من الجسيمات الفيروسية التي تحتوي على وسط واستبدلها بوسط ثقافة طازج وكامل التسخين مسبقا. في اليوم الثاني ، ابدأ في اختيار بورومايسين. استبدل وسط الاستزراع الكامل بوسط يحتوي على بورومايسين.

بعد اختيار بورومايسين ، احصد الخلايا. باتباع تعليمات الشركات المصنعة ، اعزل الحمض النووي الريبي عن الخلايا باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الريبي. استخدم مجموعة نسخ عكسي لعزل الحمض النووي التكميلي باستخدام الحمض النووي الريبي الصغير المحدد.

ثم قم بإعداد تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. لمراقبة استيعاب الحويصلات خارج الخلية بواسطة الخلايا البطانية ، تم تحليل الحويصلات الخضراء المسماة PKH67 باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. في الفحص ، يتم استخدام faloudine و hookst 33342 ، اللذان يعملان باللون الأحمر والأزرق النوكليدات ، على التوالي لتتبع انتقال الحويصلات داخل الخلايا البطانية.

تظهر الصور متحدة البؤر التي تم الحصول عليها امتصاص الخلايا البطانية للحويصلات الجاهزة بعد أربع ساعات. بعد ذلك ، لدراسة نفاذية قدرة انتشار أحادية الطبقة للخلية البطانية من rodamine b isothyosionadedextran. يوضح هذا الاختبار أن احتضان الخلايا البطانية ب 50 و 100 ميكروغرام لكل مليلتر من الحويصلات خارج الخلية زاد من نفاذية أحادية الطبقة البطانية بعد ساعتين.

في المؤامرة ، يمثل المحور x تركيز الحويصلات خارج الخلية ويمثل المحور y تغيرات الطية في نفاذية البطان المقروءة عند 590 نانومتر. بعد ذلك ، لتحديد حساسية الخلايا البطانية بعلاج بورومايسين ، تم رسم منحنى القتل. يظهر منحنى القتل أن أقل من 0.15 ميكروغرام لكل مليلتر من بورومايسين يكفي لقتل جميع الخلايا.

علاوة على ذلك ، لتحديد مستوى التعبير عن micro-RNA451a المعزول من الخلايا البطانية ، تم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي. تظهر مخططات الشريط تعبيرا مفرطا كبيرا عن نسخة micro-RNA451a ضد جين مدبرة المنزل U6. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الأمراض المعدية لاستكشاف دور Evs في تفاعل المضيف والتواصل الخلوي عن طريق نقل المادة الجينية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور امتصاص الخلايا المتلقية للمركبات الكهربائية وكيفية التحقيق في وظيفة الحمض النووي الريبي الصغيرة بما في ذلك تنظيم الخلايا البطانية.

لا تنس أن العمل مع طفيليات الملاريا ودم الإنسان يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل ارتداء القفازات ومعطف المختبر والعمل تحت غطاء معقم أثناء تنفيذ هذا الإجراء.