تنامي البلورات البروتينية مع أبعاد متميزة باستخدام الآلي تبلور مقرونا في الموقع الحيوي تشتت الضوء

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بلورة البروتين ، مثل النقطة الزمنية للتنوي أو آلية نمو البلورات أو كيفية تحضير البلورات النانوية / الدقيقة ، كما تم التحقيق فيها من قبل مركز هامبورغ للتصوير فائق السرعة. تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في مراقبة تطور العينة في الوقت الفعلي ، مما يتيح الحصول على معلومات قيمة ، مثل التوزيع الشعاعي للجسيمات في المحلول في مراحل التبلور المختلفة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للتبلور الدقيق للبروتين ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا للبروتينات المستخدمة في علم البلورات الكلاسيكي أو لنمو بلورات البروتين الكبيرة لاستخدامها في حيود النيوترونات.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا مهما ، لأنه يوضح مبدأ عمل جهاز بلورة فريد. للبدء ، قم بتصفية 16 مل من محلول طرطرات الصوديوم 1.2 مولار و 16 مل من الماء المقطر ، باستخدام مرشح حقنة معقمة 2 ميكرون. املأ الترسيب وزجاجات المياه بخمسة ملليلتر من المحاليل المفلترة.

ثم قم بتركيب الزجاجات في حاملات المضخات في الغرفة التجريبية. في نافذة البرنامج ، قم بإعداد المعلمات التجريبية بدرجة حرارة 20 درجة مئوية ، والرطوبة النسبية 20 والماء كمذيب. افتح الباب الأمامي للغرفة التجريبية وقم بإزالة حامل الغطاء.

ضع غطاء نظيفا وسيليكون على الحامل وضعه مرة أخرى في الجهاز. أغلق غرفة التجارب لتأمين الظروف البيئية. قم بتشغيل Pump Zero ، باستخدام خصائص المضخة الرئيسية الموجودة في بروتوكول النص وقم بإنشاء تيار مياه.

اضبط تيار الماء ، مع توجيه الموضع نحو مركز الغطاء عن طريق تشغيل برغي الضبط المخصص يدويا. قم بإيقاف تشغيل Pump Zero ، ثم قم بتشغيل Pump One وقم بإنشاء تيار سائل ، كما كان من قبل. اضبط موضع تيار المضخة الأولى باتجاه الموضع الثابت للمضخة صفر.

بعد إيقاف تشغيل المضخة الأولى، استبدل الغطاء المستخدم بغطاء جديد ونظيف لتجربة التبلور. قم بإنشاء ملف تجريبي جديد باستخدام حزمة البرامج. في الملف التجريبي ، أدخل البروتين باسم Thaumatin ، من Thaumatococcus daniellii. تركيز البروتين 14 ملليغرام لكل مليلتر ، والراسب طرطرات الصوديوم وتركيز الترسيب 1.2 مولار.

بعد تحميل ملف التجربة الجديد لتنشيط هذه المعلومات ، حدد الموضع على قطرة البروتين بإضافة قطرة ماء صغيرة ، باستخدام Pump Zero. اضغط على زر Tara'button لصفر الميزان الصغير. افتح الغطاء العلوي للغرفة التجريبية وقم بتعبئة 8 ميكرولترات من محلول الثوماتين على معلم المياه.

لتسجيل قطرة Thaumatin الجديدة ، انقر أولا فوق إسقاط جديد لإسناد الشروط الأولية من الملف التجريبي. ثم انقر فوق الزر الثابت لتعويض التبخر الطبيعي للماء من القطرة. استخدم كاميرا CCD للتحقق مما إذا كانت Pump Zero تهدف إلى انخفاض البروتين.

أعد ضبط موضع المضخة صفر إذا كان تيار الماء يوجه خارج القطرة. قم بتشغيل ليزر DLS وضع شعاع الليزر في قطرة البروتين باستخدام مسامير الضبط يدويا. أدخل معلمات DLS بمدة قياس 60 ثانية ، ووقت انتظار بين قياسين مدته 10 ثوان وعدد القياسات 300.

انقر فوق الزر "ابدأ" لبدء قياسات DLS. تحقق من جودة العينة عن طريق تحديد أحد تمثيلات رسومات DLS. أدخل شروط خطوة التبخر في جدول الجدولة، كما هو موضح في بروتوكول النص.

ثم قم بتنشيط خطوة تبخر العينة بالنقر فوق الأتمتة زر. انقر فوق الزر "إيقاف" عند انتهاء خطوة تبخر العينة. قم بتنشيط الزر الثابت للحفاظ على وزن القطرة ثابتا.

ستعوض هذه الميزة عن احتمالية تبخر العينة الطبيعي وتضمن عدم حدوث أي تغييرات في التركيز حتى يتم اتخاذ مزيد من الإجراءات. بعد ذلك، أدخل شروط خطوة الجمع الراسخ في جدول الجدولة، كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بتنشيط خطوة إضافة الواسب بالنقر فوق الزر "أتمتة".

لتتبع تطور قطرة التبلور بمرور الوقت ، تحقق من مظهر بلورات الثوماتين باستخدام كاميرا CCD. تحقق من توزيع حجم الجسيمات باستخدام تمثيلات الرسومات DLS. تحقق أيضا من تطور الوزن والمعلمات التجريبية باستخدام نافذة العرض.

يتم حساب جميع المعلومات المعروضة في هذه النافذة وعرضها في الوقت الفعلي، بناء على تغيرات الوزن أثناء التبلور، والتي يتم تسجيلها عبر الإنترنت بواسطة الميزان فائق الحساسية. قم بتغطية طبق تيراساكي القياسي النظيف بإضافة 3 مل من زيت البارافين إلى الطبق. قم بصرف زيت البارافين على آبار الألواح عن طريق تحريك اللوحة برفق بزوايا مختلفة بحيث يغطي الزيت جميع الآبار ال 72.

قم بإزالة زيت البارافين الزائد عن طريق سكب أي زيت يطفو على الطبق. انقر على قف زر لإنهاء تجربة التبلور. أخرج بعناية حامل العينة الذي يحتوي على قطرة التبلور.

باستخدام ماصة ، ضع قطعتين من الميكرولتر من قطرة التبلور في آبار صفيحة تيراساكي. من خلال استعادة انخفاض التبلور في صفيحة تحت الزيت ، يمكن فحص العينة بشكل دوري للتأكد من ثباتها في نمو البلورات باستخدام المجهر أو تقنيات ديولوجية أخرى تعمل مع ألواح تيراساكي. يظهر هنا توزيع مخطط نصف القطر يوضح نمو حجم الجسيمات في قطرة البروتين أثناء عملية التبلور بأكملها من البروتين الأحادي نحو تكوين النوى والبلورات النانوية والبلورات الدقيقة.

هنا ، تمثل المخططات التطور بمرور الوقت لوزن قطرة البروتين ، جنبا إلى جنب مع تركيز البروتين المحسوب وتركيز الترسيب. تظهر هنا صورة مسجلة لبلورات الثوماتين الدقيقة في نهاية التجربة. تظهر القطرة كمية وفيرة جدا من البلورات الدقيقة الصغيرة المشبعة بمحلول البروتين.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في ساعة واحدة و 30 دقيقة ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تقوم بضبط ليزر DLS في أنظمة الجرعات الدقيقة في قطرة البروتين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعامل بسهولة مع جهاز البلورة هذا من أجل بلورة عينة البروتين بنجاح.

هذه الطريقة ممكنة بسبب تشتت الضوء الديناميكي في الموقع والذي يقترن مباشرة بقطرة التبلور. هذا يسمح لنا بمراقبة جميع التغييرات في توزيع نصف القطر ، وبالتالي ، يمكننا تحديد أنماط توزيع معينة إما للتبلور أو ترسيب البروتين. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تطبيق طرق أخرى مثل المجهر الإلكتروني بالتبريد أو حيود الإلكترون للإجابة على أسئلة إضافية والتحقق من الحالة البلورية للجسيمات ذات الحجم الفرعي من الميكرومتر في المحلول.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو نظرية التنوي المكونة من خطوتين ، حيث تظهر خرائط DLS نمطا واضحا لتوزيع مزدوج الحجم للجسيمات في المحلول ، والتي تسبق نمو البلورات.