بروتوكول لمختبر الإسكان من الفيروز Killifish (فورزيري نوثوبرانتشيوس)

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تربية مستعمرة مختبرية من سمك الكيلي الفيروزي بنجاح لدراسة الشيخوخة والأمراض المرتبطة بالعمر بطريقة سريعة وعالية الإنتاجية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الشيخوخة مثل ما إذا كانت الطفرات الجينية المفردة أو التدخلات البيئية يمكن أن تعدل عملية الشيخوخة في أنواع الفقاريات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه باتباع بروتوكولاتنا الأساسية ، يمكن للعديد من المختبرات الآن إجراء تجارب باستخدام سمك الكيلي الفيروزي.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن تربية سمك الكيليفيش لها بعض الميزات الفريدة. على سبيل المثال ، يتم تربية الأجنة على ركيزة جافة قبل الفقس والتي تختلف تماما عن نماذج الأسماك الكنسية مثل سمك الزرد. للبدء ، قم بإعداد خزانات تربية سعة 9.5 لتر لكل منها ذكر يبلغ من العمر خمسة أسابيع واثنتان من الإناث البالغة من العمر ستة إلى سبعة أسابيع.

ثم املأ وعاءا بلاستيكيا بالرمل المعقمة بعمق حوالي سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات وضع الصندوق الرمل في وسط خزان التكاثر. اسمح لسمك الكيلي الفيروزي بالتكاثر بشكل مستمر وحصاد الأجنة مرة واحدة في الأسبوع لحضانة الأجنة. لحصاد أجنة مرحلة خلية واحدة لاستخدامها في الحقن وتوليد الخطوط المعدلة وراثيا ، قم بإنشاء خزان تكاثر به ذكر واحد وأنثى سمكتان كما هو موضح للتو.

قبل يومين من جمع الأجنة ، انقل الذكر إلى خزان فردي واحتفظ به على اتصال بصري مع الإناث البالغات. في يوم التجميع ، أضف الذكر وصندوق الرمل إلى حوض التكاثر واترك الأسماك تفرخ لمدة ساعتين. بعد التفريخ وإزالة الصندوق الرمل من الخزان ، أفرغ الصندوق الرمل في مصفاة واستخدم ماء النظام لشطفه.

ثم اغمر المصفاة جزئيا في ماء النظام وقم بتدويرها برفق حتى تتجمع الأجنة معا في المنتصف. باستخدام ماصة باستور سعة ملليلترين ، اجمع الأجنة وانقلها إلى طبق بتري سعة 90 ملم مع حوالي 40 مل من ماء النظام. تحت المجهر الضوئي ، افحص الأجنة الموجودة في طبق بتري وقم بإزالة الأجنة التي تظهر مشيمة ممزقة وعلامات تلف.

بعد تبييض الأجنة وفقا لبروتوكول النص ، افحص وقم بإزالة أي أجنة ميتة قد تكون ملطخة باللون الأزرق. بمجرد السماح للأجنة بالتحضين في محلول الميثيلين الأزرق الطازج ، تأكد من أن الأجنة المطورة لها عيون سوداء مرئية. ثم باستخدام ماصة باستور يمكن التخلص منها أو ملاقط منحنية دقيقة ، انقل الأجنة إلى صفيحة ورق ترشيح.

احتفظ بأي أجنة غير مكتبرتة باللون الأزرق الميثيلين وراقبها يوميا. بمجرد نمو العيون السوداء ، انقلها إلى وسط الركيزة الصلبة. باستخدام الملقط ، انشر الأجنة على بعد خمسة ملليمترات تقريبا حتى 100 جنين لكل صفيحة 90 ملم.

ثم استخدم البارافين لإغلاق الطبق واحتضان الأجنة عند 28 درجة مئوية لمدة أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع حتى تتطور قزحية العين الذهبية بالكامل وتصبح جاهزة للفقس. للتخزين طويل الأجل لمدة تصل إلى عام واحد ، بعد الحضانة في محلول الميثيلين الأزرق لمدة ثلاثة أيام ، قم بنقل الأجنة إلى ألواح متوسطة صلبة كما هو موضح للتو واحتضانها عند 17 درجة مئوية. لتفقيس الأسماك ، استخدم ملاقط منحنية دقيقة لنقل 50 إلى 100 جنين متطور بعناية إلى صندوق الفقس وغمرها بالكامل في محلول حمض الدبالية لا يزيد عمقها عن سنتيمترين عند أربع درجات مئوية.

تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول في تفريخ أجنة كيليفيش والتي يتم تحقيقها عن طريق نقل الأجنة المحتضنة على ركيزة جافة إلى محلول تفريخ يحتوي على حمض الهيوميك المزود بتهوية كافية. قم بتغطية صندوق الفقس بغطاء واحتضانه عند 28 درجة مئوية في حاضنة الفقس. لتوفير تهوية كافية ، قم بتوصيل الصندوق بمصدر هواء بأنبوب.

للحفاظ على جودة المياه الكافية في صندوق الفقس ، مرة واحدة يوميا من اليوم التالي للفقس ، قم بتجديد الصندوق بنسبة واحد إلى واحد من مياه النظام المعقمة مع الحفاظ على عمق نهائي يبلغ سنتيمترين. انقل أي أجنة غير مفرغة مرة أخرى إلى الركيزة الصلبة وحاول الفقس بعد أسبوع. لتربية الأسماك الصغيرة والبالغة بعد خمسة أيام من الفقس ، انقل الصغار إلى نظام إعادة تدوير المياه باستخدام ماصات بلاستيكية يمكن التخلص منها أو ملعقة بلاستيكية لنقل خمسة صغار بعناية لكل خزان سعة 0.8 لتر مزود بحاجز قلي 400 ميكرومتر.

في عمر 14 يوما ، انقل الأسماك الصغيرة إلى خزان سعة 2.8 لتر مزود بشاشة قلي 850 ميكرومتر. من هذه النقطة فصاعدا ، قم بتسمية كل حوض بمعرف السمكة.لمقايسات البقاء على قيد الحياة ، قم بإسكان كل سمكة على حدة في خزان واحد. يتم أيضا وضع الأسماك التي يتم تربيتها من أجل فحوصات البقاء على قيد الحياة بشكل فردي في خزان سعة 2.8 لتر.

خلال الأيام السبعة التالية ، قم بإطعام الأحداث مرتين يوميا بخمسة ملليلتر من الجمبري المالح مع استكمال ديدان الدم الحية من واحد إلى ثلاث ديدان دم حية. في عمر أربعة أسابيع ، قم بإطعام كل سمكة مرتين يوميا بالروبيان المالح ومليلتر واحد من ديدان الدم. في هذه المرحلة ، تأكد من وصول الأسماك إلى مرحلة النضج الجنسي الكاملة عن طريق التحقق من وجود زعانف ظهرية وشرجية ذيلية كبيرة مع علامات التلوين عند الذكور والبطون المستديرة المليئة بالبيض عند الإناث.

يظهر هنا منحنى بقاء تمثيلي ل 70 ذكرا من سمك الكيليفيش الفيروزي. ينتج عن التربية السليمة متوسط البقاء على قيد الحياة يتراوح من 12 إلى 28 أسبوعا في سلالة GRZ. تعتمد الاختلافات في متوسط البقاء على قيد الحياة على النظام الغذائي وتكرار التغذية وظروف درجة حرارة السكن.

يكشف منحنى البقاء للأسماك التي يتم تربيتها في ظل سوء التربية عن زيادة في معدل الوفيات المبكرة والانخفاض المفاجئ المتكرر في البقاء على قيد الحياة على مر الزمن مقارنة بالأسماك التي يتم تربيتها في ظل ظروف التربية المثلى. أثناء اتباع هذا البروتوكول ، من المهم مراقبة حالة المياه عن كثب والطعام الزائد من الزريعة الطازجة لأنه من الضروري الحفاظ عليها في بيئة نظيفة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف التلاعب التجريبي في سمك الكيلي الفيروزي بما في ذلك التحول وتحرير الجينوم والتلاعب الغذائي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تربية سمك الكيلي الفيروزي بنجاح في المختبر واستخدام هذا النموذج لاستكشاف بيولوجيا الشيخوخة في الفقاريات الأقصر عمرا والتي يمكن تربيتها في الأسر.