طريقة بسيطة وفعالة في فيفو التلاعب بالجينات الخاصة بالقلب بالحقن إينتراميوكارديال في الفئران

نقدم هنا بروتوكولا للتلاعب بالجينات الخاصة بالقلب في الفئران. تحت التخدير، تم تجسيدها في قلوب الماوس عبر الفضاء ربية الرابعة. وفي وقت لاحق، غدية تم حقن جينات محددة الترميز مع حقنه في عضلة القلب، تليها قياس التعبير البروتين عن طريق التصوير في فيفو والغربية لطخة تحليل.

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحقيق التلاعب الجيني الخاص بالقلب في الجسم الحي ، عن طريق حقن الفيروس الغدي داخل القلب في الفئران البالغة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث القلب والأوعية الدموية حول الآليات الجزيئية ومحاذاة إصابة القلب وفعالية العلاج الجيني. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها خالية من التهوية ، وأن الفئران تتعافى بسرعة من الجراحة وأنها قابلة للتكاثر وسهلة التنفيذ.

الآن ، دعنا نبدأ. في يوم الإجراء ، قم بتسخين محلول ناقل الفيروس الغدي المنقى من سالب 80 درجة مئوية ، وتخزينه على الجليد. عندما يذوب الفيروس الغدي ، ارتد قناعا للوجه وثوبا معقما وقفازات معقمة.

ورش أنبوب الفيروس الغدي بنسبة 75٪ من الإيثانول. انقل الفيروس إلى غطاء تدفق رقائقي معقم ، واستنشق 50 ميكرولترا من محلول الفيروس إلى حقنة هاميلتون معقمة سعة 50 ميكرولترا. قم بتوصيل إبرة قياس 30 بالمحقنة.

اقلب المحقنة في وضع رأسي. اضغط برفق على المكبس ، حتى تظهر قطرة من المحلول عند طرف الإبرة ، لملء طرف الإبرة بالفيروس. بعد ذلك ، قم بشفط 30 ميكرولترا أخرى من محلول الفيروس الغدي بعناية في المحقنة ، وضع المحقنة على الثلج.

لحقن الفيروس الغدي في قلب الفأر ، تأكد من المستوى المناسب من التخدير من خلال عدم الاستجابة لقرص إصبع القدم ، وقم بتطبيق المرهم على عيون. حلق الجزء العلوي من الصدر والبطن للحيوان. ضعي كريم إزالة الشعر المتاح تجاريا على البشرة المكشوفة.

استخدام الشاش المبلل لإزالة الكريم وأي شعر متبقي بعد دقيقة واحدة. باستخدام ثلاثة مقشرات مطهرة تعتمد على الكلورهيكسيدين اليود ، قم بتعقيم الجانب الأيسر السفلي من الصدر. بعد ذلك ، قم بتغطية بستارة جراحية ، مع قطع ثقب فوق منطقة الجراحة ، وارتد زوجا جديدا من القفازات المعقمة.

بعد ذلك ، باستخدام تقنية وأدوات معقمة ، قم بعمل شق جلدي بطول 0.5 سم من الخنجري إلى الإبط ، واستخدم ملقطا وإرقاء البعوض الصغير لتشريح العضلات الصدرية الرئيسية والصغرى بصراحة اسحب العضلات الصدرية الرئيسية والثانوية لفضح الفضاء الوربي. واستخدم إرقاء Micro Mosquito لاختراق وفتح المساحة الوربية الرابعة.

اضغط برفق على الجانب الأيمن من جدار الصدر بإصبع السبابة من اليد غير المهيمنة لتحريك القلب نحو الشق. ثم قم بتأمين القلب الخارجي بعناية بإصبع السبابة والإبهام من نفس اليد ، واستخدم اليد المهيمنة لحقن 10 ميكرولترات من محلول الفيروس الغدي في عضلة القلب لكل من الجدران البطنية والظهرية والجانبية للبطين الأيسر. بعد الحقنة الأخيرة ، أعد القلب على الفور إلى الفضاء داخل الصدر.

واضغط برفق على جدار الصدر باتجاه موقع الشق ، لإخلاء أي هواء يدويا من الفضاء داخل الصدر. أغلق الجلد بخيطة حريرية بخمسة ott ، في نمط مرتبة أفقي ، وضع الماوس على وسادة حرارة 37 درجة مئوية مع المراقبة حتى الشفاء التام. بعد ذلك ، قم بتعقيم حقنة هاميلتون المستخدمة وإبرة قياس 30 في معقم عالي الضغط بدرجة حرارة عالية ، وتخلص من الإبرة المعقمة في حاوية أدوات حادة مناسبة.

بعد خمسة أيام من الحقن داخل عضلة القلب للفيروس الغدي الذي يحيط باللوسيفيراز ، يشير التصوير في الجسم الحي إلى الإفراط القوي في التعبير عن لوسيفيراز ، وتحديدا في القلب ، والذي يمكن تأكيده عن طريق تحليل اللطخة الغربية ، مما يشير إلى عدم وجود نقل عضو غير مستهدف. يشير تحليل اللطخة الغربية أيضا إلى زيادة كبيرة في تعبير مستقبلات فيتامين د. والبطين الأيسر للفئران حقن بفيروس غدي يشفر مستقبلات فيتامين د.

مع انخفاض التعبير عن المستقبل الواضح في التي يتم حقنها بفيروس غدي يشفر دبوس الشعر القصير الذي يستهدف مستقبلات فيتامين د الحمض النووي الريبي. على النقيض من ذلك ، لا يتغير التعبير عن مستقبلات فيتامين د بشكل كبير في البطينين الأيمن لأي من المحقونة بالبطين الأيسر. بمجرد إتقانها ، يمكن الانتهاء من هذه الطريقة في غضون دقيقتين ، إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل حقن خلايا القلب للإجابة على أسئلة إضافية ، مثل فعالية علاجات خلوية معينة في احتشاء عضلة القلب.