طريقة بسيطة وفعالة في فيفو التلاعب بالجينات الخاصة بالقلب بالحقن إينتراميوكارديال في الفئران
أبريل 16, 2018
نقدم هنا بروتوكولا للتلاعب بالجينات الخاصة بالقلب في الفئران. تحت التخدير، تم تجسيدها في قلوب الماوس عبر الفضاء ربية الرابعة. وفي وقت لاحق، غدية تم حقن جينات محددة الترميز مع حقنه في عضلة القلب، تليها قياس التعبير البروتين عن طريق التصوير في فيفو والغربية لطخة تحليل.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تحقيق التلاعب الجيني الخاص بالقلب في الجسم الحي ، عن طريق حقن الفيروس الغدي داخل القلب في الفئران البالغة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث القلب والأوعية الدموية حول الآليات الجزيئية ومحاذاة إصابة القلب وفعالية العلاج الجيني. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها خالية من التهوية ، وأن الفئران تتعافى بسرعة من الجراحة وأنها قابلة للتكاثر وسهلة التنفيذ.
الآن ، دعنا نبدأ. في يوم الإجراء ، قم بتسخين محلول ناقل الفيروس الغدي المنقى من سالب 80 درجة مئوية ، وتخزينه على الجليد. عندما يذوب الفيروس الغدي ، ارتد قناعا للوجه وثوبا معقما وقفازات معقمة.
ورش أنبوب الفيروس الغدي بنسبة 75٪ من الإيثانول. انقل الفيروس إلى غطاء تدفق رقائقي معقم ، واستنشق 50 ميكرولترا من محلول الفيروس إلى حقنة هاميلتون معقمة سعة 50 ميكرولترا. قم بتوصيل إبرة قياس 30 بالمحقنة.
اقلب المحقنة في وضع رأسي. اضغط برفق على المكبس ، حتى تظهر قطرة من المحلول عند طرف الإبرة ، لملء طرف الإبرة بالفيروس. بعد ذلك ، قم بشفط 30 ميكرولترا أخرى من محلول الفيروس الغدي بعناية في المحقنة ، وضع المحقنة على الثلج.
لحقن الفيروس الغدي في قلب الفأر ، تأكد من المستوى المناسب من التخدير من خلال عدم الاستجابة لقرص إصبع القدم ، وقم بتطبيق المرهم على عيون. حلق الجزء العلوي من الصدر والبطن للحيوان. ضعي كريم إزالة الشعر المتاح تجاريا على البشرة المكشوفة.
استخدام الشاش المبلل لإزالة الكريم وأي شعر متبقي بعد دقيقة واحدة. باستخدام ثلاثة مقشرات مطهرة تعتمد على الكلورهيكسيدين اليود ، قم بتعقيم الجانب الأيسر السفلي من الصدر. بعد ذلك ، قم بتغطية بستارة جراحية ، مع قطع ثقب فوق منطقة الجراحة ، وارتد زوجا جديدا من القفازات المعقمة.
بعد ذلك ، باستخدام تقنية وأدوات معقمة ، قم بعمل شق جلدي بطول 0.5 سم من الخنجري إلى الإبط ، واستخدم ملقطا وإرقاء البعوض الصغير لتشريح العضلات الصدرية الرئيسية والصغرى بصراحة اسحب العضلات الصدرية الرئيسية والثانوية لفضح الفضاء الوربي. واستخدم إرقاء Micro Mosquito لاختراق وفتح المساحة الوربية الرابعة.
اضغط برفق على الجانب الأيمن من جدار الصدر بإصبع السبابة من اليد غير المهيمنة لتحريك القلب نحو الشق. ثم قم بتأمين القلب الخارجي بعناية بإصبع السبابة والإبهام من نفس اليد ، واستخدم اليد المهيمنة لحقن 10 ميكرولترات من محلول الفيروس الغدي في عضلة القلب لكل من الجدران البطنية والظهرية والجانبية للبطين الأيسر. بعد الحقنة الأخيرة ، أعد القلب على الفور إلى الفضاء داخل الصدر.
واضغط برفق على جدار الصدر باتجاه موقع الشق ، لإخلاء أي هواء يدويا من الفضاء داخل الصدر. أغلق الجلد بخيطة حريرية بخمسة ott ، في نمط مرتبة أفقي ، وضع الماوس على وسادة حرارة 37 درجة مئوية مع المراقبة حتى الشفاء التام. بعد ذلك ، قم بتعقيم حقنة هاميلتون المستخدمة وإبرة قياس 30 في معقم عالي الضغط بدرجة حرارة عالية ، وتخلص من الإبرة المعقمة في حاوية أدوات حادة مناسبة.
بعد خمسة أيام من الحقن داخل عضلة القلب للفيروس الغدي الذي يحيط باللوسيفيراز ، يشير التصوير في الجسم الحي إلى الإفراط القوي في التعبير عن لوسيفيراز ، وتحديدا في القلب ، والذي يمكن تأكيده عن طريق تحليل اللطخة الغربية ، مما يشير إلى عدم وجود نقل عضو غير مستهدف. يشير تحليل اللطخة الغربية أيضا إلى زيادة كبيرة في تعبير مستقبلات فيتامين د. والبطين الأيسر للفئران حقن بفيروس غدي يشفر مستقبلات فيتامين د.
مع انخفاض التعبير عن المستقبل الواضح في التي يتم حقنها بفيروس غدي يشفر دبوس الشعر القصير الذي يستهدف مستقبلات فيتامين د الحمض النووي الريبي. على النقيض من ذلك ، لا يتغير التعبير عن مستقبلات فيتامين د بشكل كبير في البطينين الأيمن لأي من المحقونة بالبطين الأيسر. بمجرد إتقانها ، يمكن الانتهاء من هذه الطريقة في غضون دقيقتين ، إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.
بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل حقن خلايا القلب للإجابة على أسئلة إضافية ، مثل فعالية علاجات خلوية معينة في احتشاء عضلة القلب.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول طريقة لتعديل الجينات المحددة للقلب في الفئران البالغة من خلال حقن الأدينوفيروسات داخل عضلة القلب. تتيح التقنية التعافي السريع وإمكانية التكرار، مما يجعلها مناسبة لأبحاث القلب والأوعية الدموية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- أبحاث القلب والأوعية الدموية
- العلاج الجيني
- بيولوجيا القلب
الخلفية
- فهم الآليات الجزيئية في إصابات القلب.
- تقييم فعالية العلاج الجيني في حالات القلب.
- أهمية تقنيات تعديل الجينات في الجسم الحي.
- مزايا الإجراءات غير المتهوية في النماذج الحيوانية.
هدف الدراسة
- تحقيق تعديل جيني محدد للقلب.
- التحقيق في تأثيرات الجينات المحددة على وظيفة القلب.
- توفير طريقة موثوقة للدراسات القلبية الوعائية المستقبلية.
الطرق المستخدمة
- إخراج قلوب الفئران من خلال الفضاء بين الضلعين الرابع.
- حقن الأدينوفيروسات التي ترميز جينات محددة في عضلة القلب.
- قياس التعبير البروتيني عبر التصوير الحيوي.
- تحليل البلوت الغربي لتقييم التعبير الجيني.
النتائج الرئيسية
- نجاح تعديل الجينات في أنسجة القلب.
- تعافي سريع للفئران بعد الجراحة.
- إمكانية تكرار التقنية عبر التجارب.
- قياس فعال لمستويات التعبير البروتيني.
الاستنتاجات
- البروتوكول أداة قيّمة لدراسة وظيفة الجينات القلبية.
- يسهل استكشاف تطبيقات العلاج الجيني في أمراض القلب.
- تعزز الطريقة من فهم الآليات الجزيئية للقلب.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This method enables precise cardiac-specific gene manipulation in mice, supporting target validation and mechanistic de-risking in cardiovascular drug discovery. By minimizing off-target transduction and enabling rapid recovery, it improves predictive confidence in preclinical models. The technique aligns with early discovery workflows requiring reproducible, scalable, and physiologically relevant gene modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through cardiac-specific overexpression or silencing of target genes like VDR.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating cardiac effects from systemic confounders.
- Strategic Value: Supports target confidence assessment prior to lead identification campaigns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable cardiac-specific readouts via luciferase imaging and Western blot for assay validation.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for consistent compound or vector screening in disease-relevant systems.
- Strategic Value: Enhances screening readiness by enabling standardized myocardial delivery across studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by modeling cardiac-specific gene modulation in vivo.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation with minimal procedural variability.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by confirming on-target cardiac effects.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation, enabling reliable cardiac gene modulation before lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through precise cardiac gene manipulation.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with quantitative, heart-specific outputs.
- Analytics: Provides measurable endpoints via in vivo imaging and Western blot for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through disease-relevant cardiac targeting without off-target effects.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for cardiac gene, cell, or material delivery across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through target-specific modulation and reduced biological noise.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across cardiac studies.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by isolating cardiac mechanisms and reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on confirmed cardiac target engagement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine cardiac surgery and sterile technique.
- Necessitates Hamilton syringes, 30-gauge needles, and sterile laminar flow hoods.
- Demands cross-team standardization for consistent myocardial injection volumes and depths.
- Involves adaptation considerations when scaling to different cardiac disease models.
- Limited by manual externalization technique, which may require training for reproducibility.
