استخراج هيموسيتيس من اليرقات melanogaster المورفولوجية للعدوى الميكروبية والتحليل

يمكن أن تساعد هذه التقنية في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال العدوى الخلوية وعلم الأحياء الدقيقة ، مثل كيفية مساهمة الخلايا الدموية في الاستجابة المناعية الشاملة في ذباب الفاكهة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إجراؤها في المختبر ، باستخدام اليرقات المصابة سابقا. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الخلايا الدموية من اليرقات غير المصابة للعدوى خارج الجسم الحي.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأنه يصعب تعلم خطوات التصوير بسبب تعقيدات المجهر متحد البؤر وخيارات إعادة بناء النموذج ثلاثي الأبعاد. لبدء البروتوكول ، ضع قطعتين إلى ثلاث قطع من فيلم البارافين عشرة سنتيمترات × عشرة سنتيمترات تحت مجهر استريو. بعد ذلك ، قم بإعداد الشعيرات الدموية الزجاجية عن طريق ضبط السخان القطبي الشعري على 55٪ كحد أقصى.

قطب الأنبوب الشعري إلى نقطة حادة تبلغ حوالي عشرة ميكرومترات. ردم الشعيرات الدموية بالزيت المعدني. قم بتجميع الأنبوب الشعري المملوء على حاقن النانو.

وافتح طرف الأنبوب الشعري المنصهر عن طريق قطع الحافة بالملقط. أخرج أكبر قدر ممكن من الزيت من طرف الأنبوب الشعري ، ثم املأ الأنبوب بوسط عزل ذبابة الفاكهة الدموية ، أو DHIM. لسهولة تصور حدود زيت الهيمولفان ، قم بتضمين فقاعة هواء بين الزيت و DHIM.

باستخدام الملقط ، اختر برفق عشر يرقات ذبابة الفاكهة من الطور الثالث من الجدار الداخلي لقوارير الطعام ، وضعها في مصفاة 100 ميكرومتر. صب خمسة ملليلتر من الماء المعقم على اليرقات ، ورج المصفاة لمدة خمس ثوان. ضع المصفاة على منديل مهمة لإزالة الماء الزائد.

انقل اليرقات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر ، وقم بتخديرها بغاز ثاني أكسيد الكربون لمدة خمس ثوان. بعد ذلك ، ضع اليرقات على غشاء البارافين تحت المجهر الاستريو ، بحيث يكون الجانب الظهري متجها لأعلى. ضع الشعيرات الدموية الزجاجية برفق على الجسم الخلفي لليرقات لتثبيتها في مكانها ، وقم بتعطيل البشرة الخلفية المفتوحة باستخدام ملقط مدبب ناعم.

اسمح للهيموليمف بالتدفق على فيلم البارافين. اصنع مجموعة من الهيموليمفا ، بما في ذلك الخلايا الدموية ، من 20 إلى 50 يرقة في المرة الواحدة ، على فيلم البارافين. استخدم الشعيرات الدموية الزجاجية على حاقن النانو لتناول الهيموليمفاد المجمع.

اخرج الهيموليمف في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 500 ميكرولتر من DHIM. ضع معجون الخميرة على طبق أجار عصير العنب. قم بعمل قطع دقيق في الأجار حيث يمكن أن تهاجر اليرقات لتجنب الجفاف.

قم بتجميع إبرة التنغستن المدببة 0.001 ملم مع ملقط تثبيت باستخدام فيلم البارافين. ماصة 50 ميكرولترا من العيار العالي ، mCherry تعبر عن C.Burnetii على فيلم البارافين تحت المجهر الاستريو ، ووضع اليرقات في بركة البكتيريا. وخز اليرقات بإبرة التنغستن.

انقل اليرقات إلى طبق أجار. انقل وسط العامل الممرض المتبقي إلى لوحة أجار ، وأغلق اللوحة بغشاء البارافين. احتفظ باليرقات على الطبق في هواء رطب حتى الوقت المطلوب بعد الإصابة.

اترك اليرقات المصابة ب C.Burnetii على الطبق لمدة 24 ساعة. ضع زجاجا دائريا مقاس 12 ملم في بئر من لوح 24 بئرا. ماصة 500 ميكرولتر من DHIM في البئر.

استخرج الهيموليمف وتناوله من اليرقات المصابة سابقا ، ثم اخرج الهيموليمف في البئر. الطرد المركزي للوحة على حرارة 1000 غرام لمدة خمس دقائق. قم بتكوين المجهر متحد البؤر للتصوير ثلاثي الألوان ل DAPI و EGFP و mCherry.

ضع العينة على المجهر وركز على العينة باستخدام هدف فتحة عددية 63 × 1.4. حدد موقع الخلايا الدموية المرغوبة في مجال الرؤية للتصوير. بعد ذلك ، اضبط قوة الليزر ومكاسب الكاشف لتحقيق التعرض المناسب للعينة.

تحقق من مستويات Z المتعددة للتأكد من أن مستوى التعريض مناسب لسمك العينة بالكامل. بعد ذلك ، أوجد الموضع العلوي والسفلي على المحور Z لخلية دموية كاملة. قم بتعيين هذه المواضع كموضعي البداية والنهاية للتقسيم Z.

استخدم تكبير/تصغير المسح الضوئي لتصوير المنطقة التي تحتوي على الخلية الدموية. اجمع سلسلة الصور بدقة مناسبة، مثل 1024 × 1024 بكسل في المستوى XY وتباعد 0.3 ميكرومتر في البعد Z. قم باستيراد ملف سلسلة الصور المقسم Z إلى البرنامج المرتبط بالمجهر متحد البؤر لإعادة بناء النموذج ثلاثي الأبعاد.

حدد توطين مشترك للخلايا للنوى الملطخة ب DAPI و mCherry-التعبير عن C.Burnetii في خلية دموية معبرة عن EGFP. قم بقص سلسلة الصور لتحتوي على الخلية المفردة فقط. حدد خيار عارض 3D ، الذي يعيد بناء النموذج ثلاثي الأبعاد باستخدام خوارزمية البرنامج المعبأة مسبقا.

اختر نوع التصوير المطلوب للتمثيل ثلاثي الأبعاد من بين خيارات المزج والسطح والمختلطة. في هذه الطريقة ، تظهر الخلايا الدموية والنوى و C.Burnetii باستخدام النماذج السطحية. راقب الخلية ثلاثية الأبعاد المعاد بناؤها من مواضع عرض مختلفة عن طريق الضغط على زر الماوس وسحب المؤشر حول الشاشة.

اضبط اتجاه الخلية وموضعه لمصدر الضوء المصمم لتحسين الصورة. أخيرا ، خذ المقاطع العرضية من خلال النموذج باستخدام أوامر القطع والتقسيم لتصور المحتويات الداخلية للخلية الدموية. يظهر تصور الخلايا الدموية الحية المستخرجة التي تعبر عن EGFP تحت سيطرة سائق الهيمولكتين من صور متعددة أن معظم الخلايا الإيجابية ل DAPI إيجابية أيضا ل EGFP.

تؤكد المقاطع العرضية للخلايا الدموية المصابة ب Coxiella Burnetii وجود بكتيريا تعبر عن الكرز في داخل الخلية. أعيد بناء الصور في نماذج ثلاثية الأبعاد ولاحظنا أن الخلايا الدموية المصابة في الجسم الحي أظهرت امتدادات سيتوبلازمية أكبر وكانت أكثر انبساطا في الطبيعة. بينما كانت الخلايا الدموية المصابة خارج الجسم الحي أكثر

تؤكد المقاطع العرضية لأي من النموذجين وجود mCherry التي تعبر عن Coxiella في داخل الخلية. أصيبت الخلايا الدموية المستخرجة ب IIV6 وتم تطبيقها على تحليل qRT PCR ، والذي أظهر مستويات أعلى بكثير من نسخة IIV6-193R بين الخلايا المصابة ب IIV6. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تكون جميع الوسائط جاهزة مسبقا ومتوازنة مع درجة حرارة الغرفة حتى لا تخلو الخلايا من العناصر الغذائية المناسبة لفترة طويلة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل البحث عن الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، للإجابة على أسئلة إضافية ، مثل استجابة المضيف الإجمالية للعدوى. بعد تطويرها ، تساعد هذه التقنية الباحثين في علم المناعة وعلم الأحياء الدقيقة على استكشاف غزو مسببات الأمراض واستجابات المضيف في ذباب الفاكهة ، أو الأخرى ذات الدورة الدموية المفتوحة.