الدم على أساس اختبار للكشف عن ROS1 و RET المستنسخات الانصهار من تعميم الحمض النووي الريبي استخدام الرقمية تفاعل البوليميراز المتسلسل

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل وتوصيف الحمض النووي الريبي المتداول المشتق من الورم من عينات الدم الكاملة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تشخيص الأورام. مثل كيفية الكشف عن رسائل اندماج الجينات المشتقة من الورم من الحمض النووي الريبي وعينات الدم المنتشرة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم طرقا محسنة للغاية لتثبيت واستخراج واكتشاف متغيرات الحمض النووي الريبي الموجودة في التردد المنخفض وعينات الدم. يعد الاختبار القائم على الدم مكملا لخزعات الأنسجة التقليدية مع الاستفادة من استخدام تقنية طفيفة التوغل يمكن أن توفر نتائج سريعة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للطفرات المهمة سريريا ، و NSCLC ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى حيث يلزم تحديد جزيئات الحمض النووي الريبي المنتشرة في الدم الكامل والتي يمكن الوصول إليها وبسرعة.

يتم عزل الحمض النووي الريبي المتداول لتفاعل النسخ العكسي من عينات الدم من المتبرعين كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بتحويل عينة الحمض النووي الريبي المركزة المتداولة إلى (كدنا) باستخدام مجموعة تفاعل النسخ العكسي المتوفرة تجاريا ، بما في ذلك البادئات العشوائية. قم بتضمين عينة تحكم بدون transciptase عكسي وعينة تحكم بدون RNA.

عند اكتمال تفاعل النسخ العكسي ، قم بعزل (كدنا) من مزيج التفاعل ، باستخدام عمود دوران مكثف الحمض النووي المتاح تجاريا. تسهل هذه الخطوة إزالة الإنزيمات والبادئات وثلاثي فوسفات الديوكسي نيوكليوتيد الحر. إذا لم يتم استخدام (كدنا) على الفور في تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، فقم بتخزينه عند سالب 80 درجة مئوية.

ارتد معطف مختبر التخلص وقفازات النتريل أثناء تنفيذ هذا الإجراء ومنطقة مخصصة لإعداد الكاشف. قم بتغطية المجسات لحمايتها من الضوء ، حيث يمكن للضوء المتتالي أن يبيض صبغة الفلورسنت المرفقة بالمسبار. قم أولا بإعداد خلطات تفاعل البوليميراز المتسلسل لحجم تفاعل نهائي يبلغ 20 ميكرولترا كما هو موضح في هذا الجدول ، ولكن دون إضافة الحمض النووي (كدنا) بعد.

بعد ذلك ، انقل الخلطات ، المغطاة والمحمية من الضوء إلى غطاء المحرك النظيف PCR ، الموجود في منطقة منفصلة للتضخيم المسبق. وزعي الخلطات على لوحة PCR. أضف (كدنا) المراد اختباره إلى مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

قم بتغطية اللوحة بآلة إزالة اللوح. الطرد المركزي الألواح لفترة وجيزة لجمع العينات في قاع الآبار. تخلط على شاكر طبق ، على درجة حرارة منخفضة لمدة 10 ثوان.

الطرد المركزي الألواح لفترة وجيزة مرة أخرى لجمع العينات في قاع البئر. قم بإزالة مانع تسرب اللوحة قبل إجراء توليد القطرات يدويا. من المهم تقليل الفقاعات في طرف الماصة عند تحميل العينات ثم نقل القطرات ببطء من الخرطوشة إلى اللوحة لمنع تلف القطيرات.

انقل بعناية 20 ميكرولترا من مزيج PCR إلى آبار العينة على خرطوشة توليد القطرات. أضف 70 ميكرولتر من زيت توليد القطرات. قم بتغطيتها بحشية مطاطية وانقل الخرطوشة إلى مولد قطرات يدوي لبدء توليد القطرات.

بعد توليد القطرات ، استخدم النصائح الموصى بها من قبل الشركة المصنعة لنقل القطرات إلى لوحة PCR جديدة. قم بشفط القطرات وتوزيعها ببطء ، أكثر من 5 إلى 6 ثوان لكل منها ، دون لمس نهاية طرف خرطوشة أو لوح القطرة. أغلق اللوحة باستخدام مادة مانعة للتسرب من رقائق الألومنيوم.

قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في جهاز التدوير الحراري باستخدام الإعدادات التالية. بعد اكتمال تشغيل الدراجة الحرارية ، اقرأ اللوحة باستخدام قارئ القطرات. قم بإنشاء تخطيط لوحة لبرنامج القارئ الذي يحدد موقع عناصر التحكم والعينات وتحميله في البرنامج لبدء القراءة.

يتم تحليل نتائج قراءة اللوحة باستخدام البرامج المتاحة تجاريا. ابدأ بالانتقال إلى قائمة التحليل لعرض مخططات سعة ثنائية الأبعاد أو ثنائية الأبعاد. تقييم الجودة الإجمالية للبيانات من خلال فحص بيانات القطرات.

باستخدام قائمة الأحداث، قم بتقييم البيانات لإجمالي أرقام الأحداث المقبولة. يجب أن يكون هناك أكثر من 10،000 حدث لكل بئر. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فيجب تقييم البيانات بعناية بحثا عن مشاكل إضافية.

بعد ذلك ، تحقق من البيانات بحثا عن سعات مضان بغيضة. تشير الاختلافات الكبيرة في السعة واختلافات التركيز بين العينات المكررة إلى سوء معالجة العينات أو خلطها. قم بتدوين مجموعات القطرات ذات أنماط الرش على محور 45 درجة ، مما يدل على قطرات رديئة الجودة أو عينات مشكلة.

افحص البيانات للتحكم الإيجابي ، ولا يوجد تحكم في النسخ العكسي ولا يوجد تحكم في الحمض النووي الريبي أولا. حدد جميع عينات التحكم وافحص جودة العنقود بواسطة مخطط ثنائي الأبعاد للعتبة المناسبة ، يجب أن يكون الفصل الواضح بين مجموعة القطرات واضحا. لكل متغير فحص ، قم بتعيين العتبة بناء على آبار التحكم.

قم بتعيين عتبات على مخططات ثنائية الأبعاد باستخدام أدوات الشعيرات المتقاطعة لفصل مجموعة القطرات السالبة المزدوجة عن مجموعة الجينات الضابطة على المحور x ، ومجموعة الجينات المتغيرة ، إن وجدت ، على المحور y. بعض النسخ من كل بئر متماثل لعينة واحدة. أخيرا ، عبر عن نتائج الاختبار كعدد النسخ المتغيرة المكتشفة.

باستخدام خطوط الخلايا ، معبرة عن اندماج SDC4-ROS1 واندماج CCDC6-RET ، مخفف في خلفية إجمالي الحمض النووي الريبي من النوع البري البشري ، حد الكشف كما هو محدد عند 0.2 في المائة من التردد المتغير مع كل متغير اندماج. لم يتم اكتشاف تحضير 5 في المائة من الحمض النووي الريبي المشتق من خط الخلية المستهدف ، مما يدل على خصوصية الفحص. تم قياس معايير الحمض النووي الريبي التحليلية متعددة الإرسال بتركيزات عالية ومتوسطة ومنخفضة على مدى ثلاث جولات في نفس اليوم.

ثلاث عمليات تشغيل في ثلاثة أيام متتالية ، ومع اثنين من المشغلين المستقلين. تظهر النتائج اكتشافا دقيقا لكل من نسخة الاندماج ذات الأهمية بالإضافة إلى جين التحكم الداخلي GUSB. تم أيضا تشغيل كل باخ من العينات السريرية بتحكم إيجابي ، وعدم وجود تحكم في النسخ العكسي ، والتحكم في قالب الحمض النووي

يتم تمثيل متغيرات الانصهار على طول المحور y بينما يكون GUSB على المحور x. عندما تم تقييم عناصر التحكم في الدفعات على مدار 21 يوما ، لوحظت قطرات إيجابية للاندماج وقطرات جينات التحكم في GUSB ل ROS1 و RET في جميع الجولات. يتم عرض النتائج دون المثلى للممثلين حيث يوجد تلوث داخل التحكم في عدم وجود نسخ عكسي ، والتلوث داخل التحكم في عدم وجود RNA ، ومشاركة القطرات واندماجها ، وظروف PCR المحسنة بشكل سيئ أو تثبيط PCR.

بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذا البروتوكول بأكمله في حوالي 12 ساعة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم استخدام أفضل الممارسات للتعامل مع عينات الحمض النووي الريبي والدم البشري. بعد عزل الحمض النووي الريبي ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تسلسل الجيل التالي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تحديد متغيرات الاندماج الجديدة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الحمض النووي الريبي المتداول عن الدم الكامل والبلازما ثم معالجة الحمض النووي الريبي المستعاد من أجل تحديد المتغيرات النادرة في الدورة الدموية مثل RET و ROS1. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للكشف عن الطفرات القابلة للتنفيذ سريريا من الدم الكامل. وقد قمنا بتوسيع هذه الطرق لفحص النصوص المعبرة المتداولة.