تجزئة للقرار من الأنواع هونتينجتين القابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان

الهدف العام من هذا الإجراء هو وصف أداة مفيدة لتصور وتوصيف وقياس تدفق بروتين هنتنغتين لتحليل توازن البروتين في أنظمة نموذج مرض هنتنغتون. يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في فهم الأسئلة في مجالات توازن البروتين والأمراض التنكسية العصبية مثل فهم تأثير بعض التدخلات العلاجية على التسبب في المرض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح للمحققين بعزل وحل أنواع البروتين غير القابلة للذوبان للتحليل الكمي.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للتغيرات الكيميائية الحيوية أثناء التسبب في مرض هنتنغتون ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أمراض البروتين الأخرى مثل مرض باركنسون ومرض الزهايمر. لبدء هذا الإجراء ، قم بتسمية مجموعتين من الأنابيب لكل عينة على أنها قابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان. قم بإعداد مخزن مؤقت للتحلل مباشرة قبل تحلل العينة في الأنبوب القابل للذوبان عن طريق إضافة الكمية المناسبة من المثبطات.

بعد ذلك ، أضف عازلة التحلل القابلة للذوبان التي تعمل على الجليد على البارد مكملة بمثبطات الإنزيم البروتيني إلى الأنسجة. بالنسبة لأنسجة دماغ الفأر ، قم بالتخلي ببطء 30 مرة في مثوذ زجاجي سعة مليلتر واحد. احرص على عدم كسر سطح السائل لأن الفقاعات ستتشكل وقد تؤدي إلى تجانس غير كامل.

ثم قم بتثبيتها في الأنبوب غير القابل للذوبان على الجليد. بالنسبة لخطوط الخلايا ، تم طلاء الخلايا بخمس مرات من 10 إلى الخلايا الخامسة في كل صفيحة مكونة من ستة آبار ونمت إلى ما يقرب من التقاء. بعد ذلك ، اشطف الخلايا مرة واحدة باستخدام 1X PBS البارد وقم بإزالتها.

ثم قم بتطبيق الحد الأدنى من حجم المخزن المؤقت للتحلل على الخلايا وارفعها باستخدام مكشطة الخلية. بعد ذلك ، قم بنقل التحلل المتجانس أو الخلية إلى الأنبوب غير القابل للذوبان المسمى والتحلل على الجليد لمدة ساعة واحدة. بالنسبة إلى تحلل الخلايا ، قم بعمل ثلاثية عدة مرات لتفتيت كتل الخلايا قبل بدء الحضانة وتجنب تكوين الفقاعات.

نبض دوامة كل عينة لفترة وجيزة لمدة ثانية واحدة في منتصف الطريق من خلال التحلل. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات عند أربع درجات مئوية عند 15 ، 000 × جم لمدة 20 دقيقة. ثم قم بإزالة المادة الطافية.

احرص على عدم إزعاج الحبيبات أو الطبقة الغائمة لأن ذلك سيؤدي إلى تلويث الكسر. ماصة المادة الطافية كجزء قابل للذوبان في الأنبوب القابل للذوبان واحتفظ به على الجليد. يعد تتبع مخازن التحلل القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان أمرا أساسيا.

تبديل المخازن المؤقتة أو وضع المخزن المؤقت أو العينات غير القابلة للذوبان على الجليد سيضر بنتيجة البروتوكول. اغسل الحبيبات ب 500 ميكرولتر من محلول التحلل المؤقت والطرد المركزي عند أربع درجات مئوية عند 15,000 × جم لمدة خمس دقائق. كرر الغسيل مرة أخرى.

بعد ذلك ، قم بإزالة كل المخزن المؤقت المتبقي للغسيل مع ترك حبيبات الأنسجة فقط. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات باستخدام مخزن مؤقت للتحلل مكمل بنسبة 4٪ SDS. صوتنة كل عينة لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة باستخدام مسبار صوتي.

يعد صوتنة كميات صغيرة لفترة طويلة من الزمن أمرا صعبا من الناحية الفنية. احرص على عدم فقد أي عينة عن طريق الاستحلاب أو الرش أثناء إكمال هذه الخطوة. بعد ذلك ، اغلي العينات لمدة 30 دقيقة.

ثم قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة عند 6 ، 000 × جم. بعد ذلك ، قم بإجراء فحص البروتين المتوافق مع المنظفات أو اختبار بروتين لوري لقياس تركيز البروتين. بعد ذلك ، قم بتقسيم العينات إلى دفعات 50 ميكرولتر لتجنب مشاكل التجميد / الذوبان.

في هذه الخطوة ، قم بإجراء البقع الغربية عن طريق تخفيف 30 ميكروغراما من العينة بنسبة واحد إلى واحد في المخزن المؤقت للتحميل. قم بغلي العينات لمدة خمس دقائق وقم بطردها لفترة وجيزة عند 6 ، 000 × جم. بعد ذلك ، قم بتحليل الكسور حسب صفحة SDS واللطخة الغربية.

تلطخ الغشاء بصبغة بروتين كاملة لتصور كفاءة تحميل البروتين. فيما يلي الكسور القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان من محللات خلايا HEK 293T التي تم حلها على 4-12٪ Bis-Tris و 3-8٪ Tris-Acetate على التوالي. يظهر الجزء القابل للذوبان الذي تم تطبيعه للتحكم في تحميل GAPDH تذبذب المونومر القابل للذوبان هنتنغتين إكسون 1 المتحور بناء على التعرض لمثبط الإنزيم البروتيني MG132.

يظهر الجزء غير القابل للذوبان أن الأنواع المتراكمة ذات الوزن الجزيئي العالي من هنتنغتين الطافرة يتم تعديلها أيضا عن طريق معالجة MG132. وإليك عينات من الكسور القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان من محللات خلايا HeLA باستخدام تحليل اللطخة الغربية وتأخر المرشح. تظهر البيانات أن وجود شكل إسوي SUMO معبر عنه يزيد من كل من الوزن الجزيئي العالي المتحور والطافرة غير القابلة للذوبان في الجزء غير القابل للذوبان.

يوضح هذا الشكل تنظيم تراكم هنتنغتين الطافرة ذات الوزن الجزيئي العالي بعد تعديل علاج محتمل في التجزئة غير القابلة للذوبان من خلايا HeLa على التعبير عن 97Q هنتنغتين إكسون 1. تم إسكات الهدف العلاجي PIAS1 إما باستخدام siRNA باتجاه PIAS1 أو تم التعبير عنه. تظهر الكسور غير القابلة للذوبان من مخطط الفأر المعالجة بالحمض النووي الريبي الصغير ضد PIAS1 وتم حلها على 3-8٪ من المواد الهلامية لصفحات Tris-Acetate تعديل الوزن الجزيئي العالي غير القابل للذوبان هنتنغتين.

لا تنس أن العمل مع NEM يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء قناع الوجه أثناء تنفيذ هذا البروتوكول. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية من المحللة إلى نهاية التجزئة في حوالي ثلاث إلى أربع ساعات اعتمادا على عدد العينات. يجب السماح بساعة إضافية لقياس كمية البروتين وحصره.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز أو تأخر المرشح من أجل اكتشاف القلة القابلة للذوبان أو الألياف غير القابلة للذوبان على التوالي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل وحل البروتينات غير القابلة للذوبان للتحليل الكمي.