استزراع الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية على طراز السابقين فيفو غشاء بروخ البشرية الذين تتراوح أعمارهم بين

الهدف العام من هذا الإجراء التجريبي هو إنشاء مصفوفة خارج الخلية خارج الجسم الحي تعرف باسم نظام زراعة غشاء Bruch ، لذلك يلاحظ تأثير غشاء Bruch على تراكب الخلايا الظهارية الصباغية في الشبكية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأحياء الفرعي RPE في مجال مسببات AMD مثل ما إذا كانت التغييرات في أغشية Bruch القديمة تساهم في حدوث خلل في خلايا RPE المتراكبة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح للباحثين بعزل غشاء Bruch الأصلي عن عين متبرعة بشرية من مختلف الأعمار واستخدامها لدراسة البروتينات في مزارع خلايا RPE.

عزل غشاء Bruch وإنشاء نظام ثقافة فيفو فعلي مع الحد الأدنى من الضرر الذي يلحق بغشاء Bruch الأصلي أمرا صعبا ، لكنني سأوضح لك كيف في هذا الفيديو. للبدء ، ضع شاشا مقاس 1.5 بوصة مربعة مبلل ب DMEM المستقل عن ثاني أكسيد الكربون في طبق 100 ملم. ثم قم بتحميل كرة العين على الشاش.

بعد ذلك ، استخدم شفرة جراحية لعمل شق عبر الصلبة ثلاثة ملليمترات خلف الطرف. بعد ذلك ، استخدم مقصا ذا شفرة رفيعة لعمل شق كامل السماكة وتمديد الشق محيطيا في أي من الاتجاهين حول العين. بعد ذلك ، قم بإزالة الجزء الأمامي والتخلص منه بما في ذلك القرنية والعدسة والقزحية.

أيضا ، تخلص من الجسم الزجاجي وشبكية العين. بعد ذلك ، قم بتقشير مركب المشيمية الغشائي ل RPE Bruch بعناية من الصلبة من المحيط إلى العصب البصري باستخدام ملعقة مغلفة بالتفلون. يجب أن يتم ذلك بحذر شديد حتى لا يمزق مجمع الغشاء.

الآن ، استخدم مقصا جراحيا دقيقا لعمل أربعة شقوق شعاعية في الصلبة وتقشير الصلبة. بعد ذلك ، قم بقطع الاستخراج المشيمي الغشائي لبروخ من العصب البصري وانقل هذا المصنع إلى طبق 60 ملم يحتوي على 0.02 هيدروكسيد الأمونيوم المولي في DPBS. لإزالة خلايا RPE الأصلية ، احتضان هذا النبات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد الحضانة ، اغسل النبتة ثلاث مرات باستخدام DPBS عن طريق تأمين موقع العصب البصري على غشاء Bruch باستخدام ملقط مغلف بالتفلون أثناء تدفق المحلول حول الأنسجة. بعد ذلك ، قم بتعويم جانب اللامينين المواجه لأعلى في وسائط خالية من ثاني أكسيد الكربون. قم بعمل أربعة شقوق على غشاء Bruch ثم انقل غشاء PTFE غير مصفح كاره للماء بسمك 65 ميكرون مع مسام 0.2 ميكرون فوق المصنع.

قم بإعداد هذا مع الصفيحة القاعدية مقابل غشاء PTFE. قم بإزالة السائل الزائد في الطبق ، ثم انقل المجموعة إلى نظام حامل مرشح فراغ التحليل المجهري الزجاجي حيث يجب أن يجلس على دعامة زجاجية متجفرة. بعد ذلك ، مع تجنب ملامسة الصفيحة القاعدية بعناية ، قم بتسطيح الحواف الملتفة للجانب المشيمي باستخدام ملقط مغلف بالتفلون.

الآن ، قم بتسييل 15 مل من 4٪ agarose في DPBS وتبريده إلى 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، اسكب الاغاروز ببطء على الجانب المشيمي من النبتة مع تطبيق شفط لطيف لإبقائه مسطحا. بمجرد أن يبدأ الجل في التصلب ، انقله بالغشاء إلى طبق 60 ملم على الجليد.

دع الجل يتجمد لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق ، ثم انزع غشاء PTFE. بعد ذلك ، اغمر النبات في DPBS وقم بتخزينه على درجة حرارة أربع درجات مئوية لحين الحاجة. عند زراعة النبات على طبق 60 ملم مبطن بسسائل 4٪ agarose ، اجعل غشاء Bruch متجها لأعلى.

عند الزراعة باستخدام صفيحة مبطنة بالبوليسترين مكونة من 96 بئرا ، ضع نبتة غشاء Bruch المغطاة بالهلام على ورقة تفلون مسطحة بحيث يكون جانب اللامينين متجها لأعلى. ثم ، باستخدام التريفين ، قم بقص ستة إلى ثمانية أزرار ستة ملليمترات من المصنع الخارجي وانقل أزرار الأنسجة إلى آبار محملة بالأغروز السائل. للبدء ، قم بإعداد كرة العين على شاش مبلل ب DPBS كما كان من قبل.

بعد ذلك ، قم بعمل شق محيطي بخمسة ملليمترات تحت نقطة اتصال القزحية والصلبة ، pars plana ، في الفضاء تحت الشبكية. تخلص من الجزء الداخلي والفكاهة الزجاجية وشبكية العين. بعد ذلك ، باستخدام ماصة النقل ، اغسل كوب العين بملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من DPBS البارد.

في المجموع ، اغسل كوب العين ثلاث مرات. بعد ذلك ، لفصل خلايا RPE ، عالج كوب العين بالتربسين لمدة تصل إلى 10 دقائق. بعد ذلك ، انقل خلايا RPE التربسينية إلى أنبوب سعة 50 مليلتر ، ولإخماد التفاعل ، أضف 25 مل من الوسط مع FBS عند 37 درجة مئوية.

الآن ، قم بالطرد المركزي للأنسجة والمحلول على حرارة 200 جرام لمدة 10 دقائق عند 24 درجة مئوية. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من وسط DMEM الكامل مع 15٪ FBS. الآن ، عد الخلايا وقم بتعيين 15،000 خلية RPE قابلة للحياة في 200 ميكرولتر من الحد الأدنى من الوسائط الأساسية الخالية من المصل التي تحتوي على مضادات حيوية على كل زر من غشاء Bruch في لوحة 96 بئرا.

استزراع الخلايا لمدة 24 ساعة على الأقل للتعلق. في وقت لاحق ، قم بتغيير الوسط برفق إلى DMEM الكامل الدافئ واستمر في زراعة الخلايا. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن دراسة أغشية بروخ البشرية المسنة والمريضة عن طريق زراعة خلايا RPE عليها.

عادة ما تقلل النباتات المبكرة من إعادة ارتباط خلايا RPE. كما أن خلايا RPE المزروعة على غشاء Bruch البشري المسن أقل قدرة على البلعمة في الأجزاء الخارجية للقضيب ، وهي وظيفة RPE حرجة. باستخدام المصفوفات الدقيقة ، وجد أن التعبير الجيني لخلية RPE يختلف عندما يتم زراعة الخلايا على غشاء Bruch من الأفراد الأكبر سنا مقارنة بالخلايا المزروعة على الغشاء من الأفراد الأصغر سنا.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل غشاء Bruch عن عيون المتبرعين البشريين وعمل نباتات يمكن من خلالها زراعة خلايا RPE. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ثلاث ساعات تقريبا إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر عدم لمس الجانب اللامينين من نثرة غشاء Bruch بأدوات تشريح لتجنب إتلاف السطح.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل البلعمة RPE ودراسات التعبير الجيني لخلايا RPE من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ما إذا كان غشاء Bruch من متبرع مسن مختلف أو متبرعين مصابين بالتنكس البقعي المرتبط بالعمر سيؤثر على وظائف خلايا RPE المتراكبة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التنكس البقعي المرتبط بالعمر لاستكشاف الآلية في مسببات AMD في نظام نموذج غشاء Bruch خارج الجسم الحي.