التصوير خيوط متوسطة وميكروتوبوليس مع الفحص المجهري 2-الأبعاد التعمير البصرية العشوائية المباشرة

الهدف العام لهذه المنهجية هو تهيئة الظروف التجريبية المثلى من إعداد العينة إلى الحصول على الصور وإعادة البناء من أجل إجراء تصوير D-STORM ثنائي اللون ثنائي الأبعاد للأنابيب الدقيقة والخيوط الوسيطة في الخلايا الثابتة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في توصيف التفاعلات الفيزيائية بين شبكات الهيكل الخلوي الكثيفة والمعقدة مثل الخيوط الوسيطة والأنابيب الدقيقة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بمراقبة الهياكل الخلوية ، والتي لا يتم حلها باستخدام الفحص المجهري الفلوري التقليدي.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن التحكم في إعداد العينة والحصول على بيانات ربط الرداء أمر بالغ الأهمية من أجل الحد من توليد القطع الأثرية. بعد زراعة خلايا U373 وفقا لبروتوكول النص ، قم بإصلاح الخلايا أولا باستخدام PBS لغسلها مرة واحدة. ثم قم بإزالة PBS وأضف ملليلتر واحد لكل بئر من محلول تثبيت الاستخراج المسخن مسبقا.

احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 ثانية. ثم قم بإزالة المحلول وأضف ملليلتر واحد لكل بئر من 4٪ PFA المحضر حديثا ومسخنا مسبقا المخفف في مخزن الهيكل الخلوي. ضع الطبق المكون من 12 بئرا مرة أخرى في الحاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

ثم قم بإزالة PFA وأضف ثلاثة ملليلتر من PBS لكل بئر. استخدم PBS لغسل الخلايا مرتين. ثم قم بإزالة PBS وأضف 10 ملليمولار من بوروهيدريد الصوديوم المحضر حديثا المخفف في PBS من أجل إخماد التألق الذاتي من الجلوتارالديهايد.

احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة سبع دقائق وانقل بوروهيدريد الصوديوم المعاد تدويره إلى صندوق معين. استخدم PBS لغسل الآبار ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها. ثم قم بإزالة PSB وأضف 5٪ BSA في PBS كحل حظر.

بعد تلطيخ العينات المناعية وإعداد المحاليل في المخازن المؤقتة وفقا لبروتوكول النص ، قم بتركيب الغطاء الذي يحتوي على الخلايا المسماة على حامل عينة مغناطيسي. وأضف مخزن التصوير لملء الغرفة بالكامل. ضع الغطاء وتأكد من عدم وجود فقاعات هواء بين مخزن التصوير والغطاء.

باستخدام الإيثانول المطلق ، قم بتنظيف الجزء السفلي من العينة والتحقق من عدم وجود تسريبات. ثم إذا لزم الأمر ، استخدم الشحوم لإغلاق العينة بشكل صحيح. لإجراء التصوير ، قم بتشغيل المجهر وبرنامج الاستحواذ.

قم بإعداد معلمات الاكتساب وفقا لبروتوكول النص ، باستخدام هدف NA 1.46 100 ضعاف ، وعدسة Optivar 1.6 ضعفا ، ووضع TIRF UHP. قم بإنشاء مسار 647 لتصوير خيوط vimentin المسماة ب Alexa Fluor 647. حدد خطوط الليزر 405 و 642 نانومتر ومرشح الانبعاث LP 655.

بعد ذلك ، قم بإنشاء مسار 555 لتصوير الأنابيب الدقيقة المسماة ب Alexa Fluor 555. حدد خطوط الليزر 561 و 488 و 405 نانومتر لتصوير الفلوروفورات ومرشح الانبعاث BP 570 إلى 650. بعد ذلك ، أضف الزيت إلى الهدف وضع العينة على العدسة.

ثم حدد علامة التبويب تحديد الموقع وافتح مصراع المصباح الفلوري. ابحث عن التركيز واستخدم العدسة للبحث عن الخلايا المراد تصويرها. ثم استخدم عصا التحكم لوضع الخلايا في وسط الحقل.

انقر فوق علامة تبويب الاستحواذ للعودة إلى وضع الاستحواذ. ثم حدد المسار 647 واضبط طاقة الليزر 642 على 0.2٪ وطاقة الليزر 405 على الحد الأدنى من قيمتها. اضبط وقت التعريض الضوئي على 50 مللي ثانية والكسب على 50.

ثم اختر وضع الاستحواذ المستمر لمراقبة الخلية على الشاشة. تأكد من وجود حبة فلورية واحدة على الأقل في مجال الرؤية. استخدم وضع التحجيم التلقائي للشاشة واضبط التركيز.

بعد ذلك ، التقط صورة لسان التألق لشبكة vimentin بالنقر فوق snap وحفظ الصورة. للتحقق من إضاءة TIRF ، انقر فوق TIRF ، واضغط على مستمر ، واضبط معلمات الاستحواذ من أجل الحصول على مجال إضاءة متجانس. ثم اضغط على snap واحفظ الصورة.

تحقق من المسار 555. قم بإلغاء تحديد المسار 647 ، وحدد المسار 555. التقط صورة epifluorescence لشبكة الأنابيب الدقيقة واحفظها.

ثم التقط صورة TIRF واحفظها. الآن ، تحقق من مسار 647. قم بإلغاء تحديد المسار 555 ، وحدد المسار 647.

اضبط الكسب على صفر ووقت التعريض الضوئي إلى 10 مللي ثانية. ثم اضغط على مستمر. اضبط طاقة الليزر 642 نانومتر على 100٪ لضخ معظم أصباغ Alexa 647 إلى الحالة المظلمة.

بمجرد أن تبدأ الفلوروفورات في الوميض ، قم بزيادة التعرض إلى 15 مللي ثانية والكسب إلى 300. استخدم وضع مؤشر النطاق للتحقق من أن إشارات الجزيء الفردي لا تشبع الكاميرا كما هو موضح باللون الأحمر. في هذه الحالة ، قلل الكسب حتى يختفي التشبع.

ستبقى الخرزات مشبعة في بداية الاستحواذ. اضغط على إيقاف لإيقاف مراقبة الخلية. قم بتوسيع أداة المعالجة عبر الإنترنت وانقر فوق معالجة PALM عبر الإنترنت لتصور صورة STORM أثناء الاستحواذ.

استخدم تسعة لذروة حجم القناع وستة لذروة شدة الضوضاء. الآن ، اضغط على بدء الاستحواذ. أثناء الاستحواذ ، أعد التركيز على الخلية إذا لزم الأمر.

اضبط وقت التعرض وقم في النهاية بتشغيل خط الليزر 405 نانومتر بدءا من 0.001٪ للحفاظ على كثافة متوسطة من الفلوروفورات بمسافة لا تقل عن ميكرومتر واحد بين الجزيئات المفردة. تأكد من أن ذروة دقة الترجمة على الرسم البياني أسفل الصورة المعاد بناؤها تتمحور حول أو أقل من 10 نانومتر. اضغط على إيقاف لإنهاء الفيلم عند الوصول إلى أكثر من مليون توطين.

احفظ البيانات الأولية من اكتساب STORM بتنسيق CZI. ثم في أداة القنوات، تحقق من المسار 555، وقم بإلغاء تحديد المسار 647، وحدد المسار 555. بعد ذلك ، اضغط على الزر المستمر.

اضبط وقت التعرض على 30 مللي ثانية والكسب على الصفر. ثم اضبط كل من الليزر 488 و 561 على 100٪ لضخ أصباغ Alexa 555 إلى الحالة المظلمة. استخدم وضع الإضاءة HILO.

بمجرد نفاد الفلوروفورات ، اضغط على إيقاف. اضبط الكسب على 250 وقم بتقليل ليزر 488 إلى 50٪ استخدم مؤشر النطاق للتحقق من أن الجزيئات المفردة لا تشبع الكاميرا. إذا كان الأمر كذلك ، قلل من المكاسب.

الآن ، اضغط على بدء الاستحواذ. أثناء الاستحواذ ، قم بزيادة الكسب تدريجيا للوصول إلى حد التشبع. زيادة طاقة الليزر 405 نانومتر خطوة بخطوة لتنشيط الجزيئات والوصول إلى كثافة متوسطة في مجال الرؤية.

تقليل طاقة الليزر 488 نانومتر إلى 30٪ عندما يكون ليزر 405 حوالي 15٪ ثم تقليل 488 تدريجيا مع زيادة قوة الليزر 405 من أجل الحفاظ على وميض الجزيئات بأسرع ما يمكن وبكثافة متوسطة. يزيد خط الليزر 488 إلى جانب ليزر الإثارة 561 بأقصى كثافة من معدلات التشغيل والإيقاف للفلوروفورات ، في حين أن خط الليزر 405 يزيد فقط من معدل التشغيل. أوقف الاستحواذ عند الوصول إلى 500،000 توطين أو أكثر أو عندما لا تومض المزيد من الجزيئات.

ثم احفظ البيانات الأولية من اكتساب STORM بتنسيق CZI. لإجراء إعادة بناء الصورة باستخدام أداة PAL-Drift ، اختر نوع التصحيح المستند إلى النموذج مع مقاطع تلقائية بحجم أقصى ثمانية. اضغط على تطبيق عدة مرات متتالية حتى يتم تصحيح الانحراف.

يطبق هذا التصحيح المستند إلى النموذج خوارزمية تعتمد على تحليل الارتباط المتقاطع ، والذي يصحح الانجراف. باستخدام أدوات تصفية PAL ، قم بتحسين مظهر صورة STORM عن طريق تحديد الجزيئات التي تم توطينها بشكل أفضل. على سبيل المثال ، حدد دقة الترجمة إلى 30 نانومتر و PSF إلى 120 إلى 180 نانومتر.

باستخدام أداة PAL-Render ، استخدم دقة بكسل تبلغ خمسة أو 10 نانومتر ومعلمات وفقا لبروتوكول النص. حدد عرض النطاق الديناميكي التلقائي HR بقيمة 95٪ وعرض النطاق الديناميكي التلقائي SWF بقيمة 90٪. ثم حدد عرض أفضل جودة.

في قائمة PALM في علامة تبويب المعالجة ، حدد تحويل PALM. اضغط على تحديد ثم تطبيق. أخيرا ، احفظ الصورة التي تم إنشاؤها بتنسيق LSM وليس CZI.

يوضح هذا الشكل مثالا نموذجيا لصورة D-STORM لخيوط الفيمنتين المسماة مناعية ب Alexa 647. يمكن ملاحظة الزيادة في الدقة بوضوح عند مقارنتها بالصورة التي تم الحصول عليها باستخدام مجهر قياسي واسع المجال. تظهر ملفات تعريف شدة التألق المعروضة في هذا الرسم البياني أن التصوير المجهري فائق الدقة يسمح بدقة حزم الفيمنتين.

دقة D-STORM كافية لحساب عدد الخيوط الموجودة في الحزم. يظهر هنا مثال نموذجي لتصوير D-STORM ثنائي اللون لشبكات vimentin و microtubule المصنفة مناعية مع Alexa 647 و Alexa 555 ، على التوالي. يجب أن تحتوي صور vimentin الجيدة على ما لا يقل عن 5،000 توطين لكل ميكرومتر مربع و 2،500 لكل ميكرومتر مربع للأنابيب الدقيقة.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ثلاثة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم تكييف طرق التثبيت والمعلمات مع البروتين الذي سيتم تصويره. على سبيل المثال ، يعطي التثبيت باستخدام الجلوتارالديهايد فقط نتائج سيئة للخيوط الوسيطة ، ولكنه الأفضل لتثبيت الأنابيب الدقيقة.

المهم أن تتذكر استخدام العينات والمحاليل المعدة حديثا ، وخاصة MEA ، التي يجب ضبط درجة الحموضة الخاصة بها بعناية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلية لاستكشاف مورفولوجيا الهياكل الخلوية النانوية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء إعداد العينة ، والحصول على الصور ، وإعادة بناء صور D-STORM ثنائية اللون ثنائية الأبعاد للخيوط الوسيطة والأنابيب الدقيقة.

لا تنس أن العمل مع بعض الحلول ، وخاصة PFA ، يمكن أن يكون NABH4 خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات والعمل تحت الغطاء الكيميائي واستخدام صناديق محددة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.