لحاء Sap أخذ العينات من كرنب نابوس 3D-صفحة من البروتين ومجمعات ريبونوكليوبروتين

الهدف العام من هذا الإجراء 3D-PAGE هو فصل مجمعات البروتين والبروتين النووي الريبي عن عصارة Brassica napus ploem ، إلى جانب تحديد مكونات الحمض النووي والبروتين المعنية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في الكيمياء الحيوية وفسيولوجيا النبات. على سبيل المثال ، يمكنك تحليل تكوين مجمعات اللحاء تحت الضغط.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن جمع عصارة اللحاء النقي ويمكن تحليل الأحماض النووية وكذلك مكونات البروتين في وقت واحد. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على بروتين البروتين وتفاعلات الحمض النووي البروتيني داخل نظام اللحاء لاغتصاب البذور الزيتية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على تحليل اللحاء للنباتات الأخرى مثل القرعيات والترمس واليوكا. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما حاولنا تحديد شركاء تفاعل البروتين والحمض النووي الريبي لبروتين لحاء معين.

أولا ، قم بثقب الجذع الإزهاري لنبات B.napus البالغ من العمر ثمانية أسابيع عدة مرات باستخدام إبرة تحت الجلد 0.8 ملم. ثقب العديد من السيقان الزهرية الأخرى على نفس النبات والنباتات الأخرى للحصول على ما يكفي من عصارة اللحاء. امسح القطرة الأولى من كل موقع مصاب بورق ترشيح.

بعد إزالة القطرات الأولى ، استخدم ماصة لجمع القطرات المتبقية. ونقلها إلى أنبوب تفاعل مخروطي الشكل مبرد مسبقا سعة 1.5 ملليلتر. ثم قم بتخزين الإفرازات المجمعة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر باستخدام نظام تبريد خال من الثلج.

استمر في جمع القطرات حتى لا يلاحظ تكوين المزيد من القطرات ، ولكن ليس أكثر من ساعة واحدة. بعد ذلك ، أضف عينة اللحاء إلى مكثف الطرد المركزي بوزن جزيئي مقطوع من 10،000 دالتون ، وركز على ما يقرب من 1/6 من الحجم الأولي. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة المركزة عند أربع درجات مئوية و 20،000 جم لمدة 15 دقيقة على الأقل لإزالة جزيئات الغبار.

لأداء الصفحة الزرقاء الأصلية ، قم بتجميع غرفة الجل. وأضف عازلة الكاثود الزرقاء الداكنة B إلى النصف ، واغسل الآبار باستخدام عازلة الكاثود. قم بتحميل 20 إلى 30 ميكروغراما من عينة البروتين المركزة لكل بئر على جل مشع تجاري Bis-Tris بثلاث نسخ على الأقل.

املأ الغرفة بالكاثود والمخزن المؤقت للأنود ، وقم بتشغيل الجل عند أربع درجات مئوية و 150 فولت حتى تمر العينة بمقدار 1/3 من الهلام ، الأمر الذي يستغرق من 20 إلى 30 دقيقة. أوقف تشغيل المخزن المؤقت للكاثود الأزرق الداكن B مؤقتا باللون الأزرق الفاتح B مع المخزن المؤقت للكاثود الأزرق الفاتح B 1/10. أعد تشغيل الجري واستمر حتى تبدأ الجبهة الزرقاء في الخروج من الجل ، الأمر الذي يستغرق من 120 إلى 180 دقيقة.

اقطع ممر جل كامل من الجل الأزرق الأصلي ، ثم انقله إلى غشاء نايلون عن طريق نشاف شبه جاف ، وقم بتمييز حدود الجل العلوية والسفلية على الغشاء بقلم رصاص. بعد النشاف ، اغسل الغشاء بالماء المعالج DEPC وضعه بين قطعتين من ورق الترشيح حتى يجف. بعد ذلك ، قم بإجراء الربط المتقاطع للأشعة فوق البنفسجية للغشاء الملطخ بطاقة مطبقة تبلغ 120 ، 000 جول ميكرو لكل سنتيمتر مربع.

الآن ، قم بتهجين الغشاء المتقاطع للأشعة فوق البنفسجية مسبقا بستة ملليلتر من مخزن التهجين لمدة 60 دقيقة عند 68 درجة مئوية في فرن التهجين. أضف مليلترا إضافيا واحدا من المخزن المؤقت للتهجين يحتوي على أربعة ميكرولترات من مجسات البيوتينيل المكونة من 3 أوليات إلى الغشاء. بعد ذلك ، احتضان الغشاء بالمسبار طوال الليل أثناء تبريد فرن التهجين من 68 إلى 37 درجة مئوية.

في اليوم التالي ، اغسل الغشاء بمخزن مؤقت يحتوي على 2x SSC و 0.1٪ SDS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة المجسات المرتبطة بشكل غير محدد. قم بالكشف عن مجسات البيوتينيل المكونة من 3 أوائم على الغشاء باستخدام ستربتافيدين HRP المترافق واللومينول كركيزة بيروكسيداز الفجل الحار ، مما يؤدي إلى تفاعل كيميائي حساس. استكمال العصابات المفردة من الجل الأصلي الأزرق.

اجمع بين النطاقات من العينات التي تعمل في ممرات متوازية في أنبوب تفاعل مخروطي سعة 1.5 مليلتر لتحقيق تركيز إضافي للبروتينات المعقدة. لتحضير هلام اليوريا 12٪ Tris-Tricine ، صب 10 مل من محلول الجل A بين لوحين زجاجيين وتراكب مع الأيزوبروبانول. بعد البلمرة ، قم بإزالة الأيزوبروبانول ، وأضف ملليلترتين إلى ثلاثة ملليلترات من محلول الجل B إلى الجل ، وأدخل مشطا 10 جيدا.

لموازنة قطع الهلام المستأثورة ، أضف ملليلتر واحدا من 2x SDS المخزن المؤقت للعينة في أنبوب التفاعل. بعد احتضان العينة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، سخنيها في كتلة تسخين عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة تقريبا. ثم احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بتكديس العديد من قطع الجل المتوازنة التي تمثل نفس المركب في جيب هلام واحد. بعد تجميع حجرة الهلام ، قم بإجراء الرحلان الكهربائي باستخدام المخازن المؤقتة لتشغيل الأنود والكاثود عند 150 فولت لمدة 45 إلى 60 دقيقة. عند الانتهاء ، قم باستئصال حارة الجل بالكامل.

احتضان حارة الجل المقطوعة لمدة 20 دقيقة في عازلة حمضية. بعد ذلك ، قم بالتوازن في 125 ملليمولار Tris-HCL عند درجة الحموضة 6.8 لمدة 20 دقيقة أخرى. صب محلول جل فصل SDS بنسبة 15٪ وفقا للري.

بمجرد أن يتجمد الجل ، قم بإزالة الأيزوبروبانول ، وأضف ثلاثة ملليلتر من محلول جل التراص بنسبة 4٪ ، وأدخل المشط الخاص للمواد الهلامية IPG. بعد التصلب ، انقل ممر الجل المتوازن إلى هلام SDS ، وقم بتغطية الجل بنسبة 0.5٪ agarose في 1x SDS تشغيل عازلة مكملة بأثر من البروموفينول الأزرق. بعد تجميع حجرة الجل ، قم بتشغيل الجل بجهد 150 فولت لمدة 60 دقيقة.

عند الانتهاء ، قم بتلطيخ الجل بمحلول كوماسي الغروي لتحليل طيفي الكتلة اللاحق. أخيرا ، قم بتحليل بقع البروتين المرئية باستخدام مطياف وقت الرحلة بالليزر بمساعدة المصفوفة. يتم تصوير نتيجة تمثيلية تم الحصول عليها من عينة لحاء نقية هنا.

تظهر عينات اللحاء غير الملوثة نطاقا مرئيا لعمر الثيوريدوكسين ، بينما لم يتم ملاحظة أي إشارة ل RuBisCO وبروتين طبقة حبوب اللقاح. تصبح أربعة نطاقات معقدة بروتينية رئيسية على الأقل مرئية بعد BN PAGE من عصارة B.napus phloem. لا تسمح التركيزات المنخفضة جدا أو العالية جدا من عصارة اللحاء بفصل واضح للمجمعات.

لوحظ فصل عالي الدقة في 3D PAGE بسبب سلوكيات هجرة البروتين المختلفة في اليوريا والمواد الهلامية SDS-PAGE. عادة ما تكون البروتينات التي تنتمي إلى مركب واحد مرئية كخط قطري عبر الجل. البروتينات الموجودة فوق هذا الخط لها كراهية ماء متزايدة ، في حين أن البروتينات الموجودة أسفل الخط تكون أكثر محبة للماء.

يظهر نشاف BN الشمالي أن الحمض النووي الريبي المرسال المحدد موجود فقط في مجمع واحد محدد. أظهر التحليل الطيفي الكتلي أن هذا المركب يحتوي بشكل أساسي على ليغازات الحمض النووي الريبي المرسال التي تؤكد نشاط ربط الحمض النووي الريبي الذي تم العثور عليه بواسطة نشاف BN الشمالي. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ثلاثة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر ارتداء القفازات ومعطف المختبر لتقليل تلوث الكاروتين الذي سيعيق التحليل الطيفي الكتلي. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التصوير الوزيناتي ومقايسات الإنزيم مع عصارة اللحاء المجمعة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل الأنشطة المعقدة ودراسات التثبيط. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علوم النبات لاستكشاف مجمعات متعددة الوحدات الفرعية في عينات اللحاء من أنواع نباتية مختلفة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل عصارة اللحاء من نباتات Brassica napus ، وكيفية عزل وتحليل بروتين البروتين ومجمعات الحمض النووي البروتيني. لا تنس أن العمل مع SDS و acrylamide و TMET يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل العمل تحت غطاء المحرك مع القفازات ومعطف المختبر أثناء تنفيذ هذا الإجراء.