تشريح مجمعات البروتين متعدد الإشارات بالتكامل Bimolecular انجذاب تطهير (بيكاب)

يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا الخلية والكيمياء الحيوية ، مثل كيفية تحكم التجميع الديناميكي لمجمعات البروتين والبروتين في مسارات الإشارات وسلوك الخلية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا عزل بروتينين متفاعلين على وجه التحديد ، مع استبعاد البروتينات الفردية غير المعقدة ، وشركاء الربط المتنافسين. على الرغم من أننا نستخدم هذه الطريقة لتقديم نظرة ثاقبة لثنائي التيروزين كيناز المستقبلي في سرطان الثدي ، إلا أنه يمكن أيضا تطبيقها على أي بيئة فسيولوجية أو مرض آخر.

كانت لدينا فكرة لأول مرة عن هذه الطريقة عندما أدركنا أن الجسم النانوي GFP يتعرف على الحاتمة ثلاثية الأبعاد ل GFP وبروتينات الفلورسنت الأخرى. للبدء ، أضف 150 نانوغراما من متجه الدخول ، و 150 نانوغراما من متجه الوجهة ، وثمانية ميكرولتر من المخزن المؤقت TE ، إلى أنبوب 0.2 ملليلتر. بعد ذلك ، أضف ميكرولترين من recombinase و ZiMex ، وقم بالطرد المركزي للاثنين لفترة وجيزة.

احتضن التفاعل لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، ثم أضف ميكرولتر واحد من محلول البروتيناز K ، واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإيقاف التفاعل. بعد ذلك ، قم بإذابة الخلايا المختصة بالصدمات الحرارية على الجليد. ونقل 50 ميكرولترا من الخلايا إلى أنبوب بولي بروبلين دائري القاع سعة 14 مل.

أضف ميكرولتر واحد من منتج التفاعل إلى الخلايا واخلطه برفق. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة على الجليد. ثم صدم الخلايا بالحرارة في حمام مائي بدرجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية قبل إعادة الخلايا إلى الجليد.

أضف ملليلتر واحد من وسائط LB إلى الخلايا. واحتضان العينة بالرج لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بوضع التحويل على صفيحة أجار 10 سم مع أمبيسلين ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية طوال الليل.

لبدء تنقية البلازميد ، أضف الأمبيسلين و 100 مل من وسائط LB إلى قارورة مخروطية كبيرة. ثم استخدم حلقة التلقيح لإزالة مستعمرة واحدة من لوحة أجار. اغمر حلقة التلقيح في وسائط LB واخلطها لفترة وجيزة ، ثم قم بتغطية الجزء العلوي من القارورة بورق الألمنيوم ، واحتضانها طوال الليل ، عند 37 درجة مئوية مع الرج.

من هنا ، قم بتنقية الحمض النووي البلازميد باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي البلازميد Maxiprep القياسية ، قبل الشروع في التعدين. أولا ، قم ببذور خلايا HEK 293T في أطباق 10 سم ، تحتوي على 10 ملليلتر من DMEM. ثم قم بتخفيف 2.5 ميكروغرام من كل ناقل تكميل مضان ثنائي الجزيئات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتعدين.

أضف 10 ميكرولترات من كاشف الإرسال ، وقم بتدوير الخليط لمدة 10 ثوان. ثم قم بالطرد المركزي للعينات لفترة وجيزة ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، أضف خليط تعداء الحمض النووي بالتنقيط إلى الطبق.

ثم احتضان العينات لمدة ثماني إلى 24 ساعة. قم بإعداد مخزن مؤقت لتحلل الخلايا ومخزن مؤقت لتحلل الخلايا المكمل كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم اغسل الخلايا باستخدام PBS المثلج البارد مرتين.

استنشق PBS وأضف ملليمترا واحدا من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا المكملة بالثلج. بعد ذلك ، ضع الطبق على الثلج واحتضنه لمدة خمس دقائق. ثم استخدم مكشطة خلية لإزالة الخلايا ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مبرد.

قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 18،000 مرة من الجاذبية لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، لإزالة الحطام الخلوي ، ثم نقل المادة الطافية الصافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. اغسل حجما مناسبا من حبات الاغاروز في مليلتر واحد من PBS ، ثم قم بالطرد المركزي للحبات عند 300 مرة من الجاذبية ، وقم بإزالة المادة الطافية بعناية. بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من حبات الاغاروز إلى كل عينة.

واحتضان عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين ، مع دوران من طرف إلى طرف. الطرد المركزي للحبات عند 300 مرة من الجاذبية وغسلها في مخزن تحلل الخلايا ثلاث مرات. ثم أعد تعليق الخرزات المغسولة في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة المخففة.

أخيرا ، قم بتسخين العينات عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. في هذه الدراسة ، يتم استخدام طريقة BiCAP لمراقبة تفاعل إيجابي للعديد من أنواع البروتين بعد حوالي 16 ساعة من التعدي المشترك لخلايا HEK293T. يستخدم الفحص المجهري البؤري لمراقبة تثبيط RTKERBB2 في غشاء البلازما ، وارتباط يوبيكويتين ب E3 ligase UBR5.

بعد تنقية التقارب مع الجسم النانوي GFB ، يمكن اكتشاف بروتين التحكم في كوكب الزهرة كامل الطول فقط ، والبروتينات المتفاعلة V1 و V2 في عينة التعداء المشتركة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، تذكر تحسين وضع علامة تكملة التألق ثنائي الجزيئات ، وإما الطرف C أو الطرف N للبروتين الذي تهمك. هذا ضروري لملاحظة تفاعل إيجابي بين البروتين / البروتين.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ تقنية BiCAP ، وكيفية تطبيقها على تفاعل البروتين الذي يثير اهتمامك. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام العديد من تقنيات التوصيف النهائية ، مثل ChIPseek للإجابة على أسئلة إضافية ، مثل كيفية تثبيط عوامل النسخ في ربط الحمض النووي.