رواية السلبي مسح أساليب للإنتاج السريع للشفافية الضوئية في كامل أنسجة الجهاز العصبي المركزي
مايو 8, 2018
نقدم هنا، منهجيات رواية اثنين وبسباكت و mPACT، لتحقيق أقصى حد من الشفافية الضوئية والتحليل المجهري اللاحقة للمفرج الأنسجة في القوارض سليمة كامل الجهاز العصبي المركزي.
الهدف العام من طرق psPACT و mPACT هذه هو التطهير السريع لأنسجة الجهاز العصبي المركزي بالكامل دون الحاجة إلى نظام تطهير الأنسجة الكهربائية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال نموذج أبحاث الأمراض البشرية ، مثل مرض الزهايمر أو الإصابة والتنكس وتكوين الأورام. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن أنسجة الجهاز العصبي المركزي للفأر لا تتضرر من تطهير الأنسجة الكهربية ، ويتم إزالتها بسرعة عن طريق المقاصة السلبية المعدلة.
خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة بعد استخدام PACT الأصلي والطريقة السابقة لتطهير الدماغ. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تشغيل طريقة psPACT و mPACT لأن هذه الطريقة لها مراحل متعددة من إعداد العينة. ابدأ بتحضير محلول كوكتيل PACT عن طريق إضافة مسحوق VA-044 إلى محلول 4٪ PFA و 4٪ أكريلاميد بتركيز نهائي قدره 0.25٪ بعد حشو الأنسجة بمحلول PACT ، اغمر الدماغ والحبل الشوكي بالكامل في أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على محلول PACT المبرد ، وخزنه عند أربع درجات مئوية لمدة 24 ساعة.
بعد 24 ساعة ، انقل الأنسجة إلى أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على محلول PACT طازج وبارد ، وقم بتوصيل غطاء الأنبوب بنظام تهجين هلام الأنسجة ، المتصل بخزان النيتروجين وضبطه على 37 درجة مئوية. ثم قم بتشغيل الفراغ والغاز لمدة 10 دقائق لتضمين العينة في غاز النيتروجين. لبلمرة الهيدروجيل ، ضع الأنبوب الذي يحتوي على العينة في حاضنة اهتزاز مضبوطة على 150 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات أو حتى تكتمل البلمرة.
بعد الحضانة ، استخدم ورق النشاف لإزالة الهيدروجيل المبلمر المتبقي المحيط بالأنسجة. ثم انقل الأنسجة إلى أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على محلول مقاصة. ضع العينة في حاضنة اهتزاز مضبوطة على 37 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة حتى يتم تنظيف الأنسجة.
في المتوسط ، يستغرق الجهاز العصبي المركزي للماوس حوالي 20 يوما لتحقيق الوضوح الكامل. ابدأ psPACT باستخدام الجهاز العصبي المركزي من ماوس مملوء بنسبة 4٪ PFA تم تثبيته لاحقا في 4٪ PFA عند أربع درجات مئوية لمدة 24 ساعة. اغسل الأنسجة الثابتة لمدة ساعة واحدة في 0.1 مولار PBS.
بعد الغسيل ، انقل الأنسجة إلى محلول A4P0 ، واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، بعد غسل الأنسجة في PBS لمدة خمس دقائق ، اغمر الأنسجة في 0.25٪ VA-044 في PBS ، واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ست إلى 24 ساعة. يؤدي فصل مادة الأكريلاميد وخطوة VA-044 اللاحقة إلى تجنب الحاجة إلى إزالة مونومرات الهيدروجيل غير المبلمرة المتبقية التي تحيط بالأنسجة ، والتي يمكن أن تضر بسلامة الأنسجة النهائية بعد تحقيق الشفافية مع PACT.
بعد الحضانة ، انقل الأنسجة إلى محلول VA-044 الطازج والبارد. ثم قم بتضمين العينة في غاز النيتروجين لمدة 10 دقائق. نقل الأنسجة إلى محلول التطهير.
بعد ذلك ، قم باحتضان العينة في حاضنة اهتزاز مضبوطة على 37 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة حتى يتم تنظيف الأنسجة. في المتوسط ، يستغرق الجهاز العصبي المركزي للماوس حوالي 17 يوما لتحقيق الوضوح الكامل. بالنسبة إلى mPACT، اتبع بروتوكول psPACT حتى خطوة حل المقاصة.
بعد ذلك ، اغمر محلول تنظيف الأنسجة بالكامل الذي يحتوي على 0.5٪ ألفا ثيوجلسرين ، وهو عامل غير بني ، بالإضافة إلى 8٪ SDS في 0.1 مولار PBS. ضع العينة في حاضنة اهتزاز مضبوطة على 37 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة حتى يتم تنظيف الأنسجة. في المتوسط ، يستغرق الجهاز العصبي المركزي للماوس أسبوعين فقط لتحقيق الوضوح الكامل باستخدام mPACT.
في هذه الدراسة ، حققت عينات دماغ الفئران التي عولجت عبر بروتوكول mPACT الشفافية البصرية بعد 14 يوما ، قبل العينات التي تم علاجها عبر بروتوكولات PACT و psPACT. حققت عينات الجهاز العصبي المركزي الكاملة للفئران التي تم تطهيرها بواسطة mPACT أقصى تخليص في 20 يوما. تم تطهير أدمغة الفئران البالغة وحدها ، على عكس الجهاز العصبي المركزي بأكمله ، باستخدام mPACT في خمسة أيام فقط.
بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون أسبوعين باستخدام الجهاز العصبي المركزي بالكامل للفأر إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب والتشريح لاستكشاف الأمراض الفيزيولوجية المرضية ، مثل إصابة الأنسجة والتشوهات التنموية والسرطان والأمراض التنكسية العصبية في نماذج الجهاز العصبي المركزي للثدييات.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة منهجيتين مبتكرتين، psPACT وmPACT، لتعزيز الشفافية الضوئية وتسهيل التحليل المجهري للأوعية الدموية السليمة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) للقوارض. تهدف هذه التقنيات إلى تطهير أنسجة الجهاز العصبي المركزي بالكامل بسرعة دون إتلافها، وذلك لمعالجة أسئلة رئيسية تتعلق بنماذج الأمراض البشرية مثل مرض ألزهايمر وتكون الأورام.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم الأعصاب
- تقنيات شفافية الأنسجة
- التصوير المجهري
خلفية علمية
- تعتمد هذه الدراسة على طرق سابقة، مع تسليط الضوء على قصور تقنيات تصفية الأنسجة بالترحيل الكهربائي.
- تؤكد على الحاجة إلى عمليات تصفية سريعة وفعالة لأنسجة الجهاز العصبي المركزي لدى القوارض.
- تقدم حلولاً لكل من الأبحاث الأساسية والتطبيقات السريرية في علوم الأعصاب.
الغرض من الدراسة
- تطوير والتحقق من صحة بروتوكولي psPACT وmPACT كبروتوكولات فعالة لترويق أنسجة الجهاز العصبي المركزي.
- توسيع القدرات المتاحة للباحثين الذين يدرسون الحالات المرضية العصبية.
- تسهيل التصوير بشكل أفضل للأوعية الدموية في أنسجة الجهاز العصبي المركزي.
الطرق المستخدمة
- تتضمن الطرق بروتوكولاً متعدد المراحل لتحضير وتصفية أنسجة الجهاز العصبي المركزي باستخدام محلول PACT.
- تشمل النماذج البيولوجية الرئيسية عينات من الجهاز العصبي المركزي للفئران والجرذان، مع التركيز على تحقيق الشفافية الضوئية.
- تستغرق عملية psPACT عموماً حوالي 20 يوماً للوصول إلى الشفافية الكاملة، بينما يمكن لعملية mPACT تحقيق ذلك في غضون 14 يوماً تقريباً.
- تُستخدم محلولاً وبيئات تحضين متخصصة لعمليات البلمرة والتصفية.
النتائج الرئيسية
- توفر تقنية mPACT اختزالاً كبيراً في الوقت اللازم لترويق الأنسجة مقارنة بالطرق التقليدية.
- أظهرت العينات المعالجة بـ mPACT شفافية بصرية في إطار زمني أقصر، مما يشير إلى تعزيز الكفاءة في تطبيقات الأبحاث.
- أثبتت هذه التقنيات فعاليتها في تسهيل دراسة مختلف الحالات العصبية.
الاستنتاجات
- تمكن هذه الدراسة من إجراء عملية ترقيق سريعة وفعالة لأنسجة الجهاز العصبي المركزي، مما يعزز القدرات البحثية في مجال علوم الأعصاب.
- تعد هذه المنهجيات المبتكرة أدوات قيمة لاستكشاف آليات المرض وإصابات الأنسجة.
- توجد آثار جوهرية لهذه الدراسة في فهم الأمراض التنكسية العصبية وتحسين الدراسات الباثولوجية من خلال تقنيات تصوير مطورة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تعالج طرق الترويق السلبي المبتكرة مثل psPACT وmPACT عقبة حرجة في مجال البحث والتطوير في علوم الأعصاب من خلال تمكين تحقيق شفافية بصرية سريعة وعالية الدقة لأنسجة الجهاز العصبي المركزي الكاملة دون حدوث تلف ناتج عن الرحلان الكهربائي. وتدعم هذه القدرة عملية التحقق من الأهداف وتقليل المخاطر الميكانيكية في نماذج الأمراض التنكسية العصبية من خلال الحفاظ على البنية تحت الخلوية مع تسريع الجداول الزمنية للتصوير. كما تعزز هذه التقنيات من الثقة التنبؤية في الدراسات قبل السريرية لمرض الزهايمر، وتكون الأورام، ونماذج الإصابات من خلال تحسين تصور الأنماط الظاهرية المرضية العصبية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير الصيدلاني الحيوي
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية في نماذج الجهاز العصبي المركزي السليمة من خلال الحفاظ على البنى دون الخلوية والدوائر الخلوية لدراسات ارتباط الهدف.
- القيمة التشغيلية: تقلل من الشوائب الناتجة عن معالجة الأنسجة المرتبطة بالتصفية بالرحلان الكهربائي، مما يحسن من إمكانية تكرار نتائج الفرز المظهري.
- القيمة التنبؤية: تدعم عملية فرز المحفظة الدوائية من خلال توفير قراءات أكثر وضوحاً لتطور التنكس العصبي في الأنظمة ذات الصلة بالمرض.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يعمل على إنتاج تحضيرات نمطية وشفافة للجهاز العصبي المركزي (CNS) مناسبة للتصوير عالي الدقة للمؤشرات الحيوية دون الخلوية وتعديل المسارات.
- القيمة التشغيلية: يلغي الحاجة إلى معدات الرحلان الكهربائي المتخصصة، مما يقلل من عوائق تنفيذ المقايسة عبر فرق الاكتشاف.
- القابلية للتوسع: يحقق mPACT شفافية الجهاز العصبي المركزي للفئران في غضون 14 يومًا تقريبًا، مما يتيح جداول زمنية يمكن التنبؤ بها لحملات فحص المركبات.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الانتقالية: تسهل الانتقال السلس من مرحلة الاكتشاف إلى التحقق قبل السريري من خلال الحفاظ على سلامة الأنسجة للدراسات الطولية حول تكون الأورام والتشوهات التنموية.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: تتيح تصور البنى تحت الخلوية في الأنسجة المرضية، مما يقلل من الغموض في تفسير آلية الهدف.
- دقة نموذج المرض: تدعم التصفية المتسقة للجهاز العصبي المركزي عبر أنواع القوارض (الفأر/الجرذ)، مما يعزز إمكانية المقارنة بين الدراسات في علم الصيدلة الخاص بالسلامة.
تكامل مسارات العمل وسير العمل
يتناسب نظاما psPACT وmPACT ضمن التسلسل الممتد من مرحلة الاكتشاف المبكر إلى الدراسات قبل السريرية، حيث يدعمان تحديدًا التحقق من الهدف وصولاً إلى تحسين المركبات الرائدة، وذلك من خلال توفير نماذج للجهاز العصبي المركزي قابلة للقياس الكمي والجاهزة للتصوير.
- بيولوجيا الاكتشاف: تتيح اختبار الفرضيات عبر رسم خرائط ثلاثية الأبعاد لتعبير البروتين وتوزيع الخلايا في الأنسجة السليمة، مما يوضح مشاركة المسارات في نماذج الأمراض.
- الفحص: توفر تحضيرات نسيجية كمية قابلة للتكرار تدعم التقييم الموحد لتأثيرات المركبات على بنية الجهاز العصبي المركزي.
- التحليلات: تُنتج مخرجات تصوير عالية الدقة تسمح للفرق بمقارنة التغيرات الهيكلية عبر ظروف العلاج المختلفة مع تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
- الأبحاث الانتقالية: تحافظ على الاستمرارية البروتينية والهيكلية من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى المراحل قبل السريرية، مما يدعم مواءمة المؤشرات الحيوية في نماذج التنكس العصبي والإصابة.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لتصفية الجهاز العصبي المركزي يمكن تطبيقها عبر مشاريع متعددة تدرس الاعتلالات العصبية، مما يقلل من التكرار في تطوير الطرق.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال تقليل الغموض الميكانيكي عبر التصوير المرئي للأنسجة السليمة.
- القيمة التشغيلية: تعزز التوحيد القياسي وقابلية التكرار من خلال تجنب معاملات الرحلان الكهربائي المتغيرة والاعتماد على الأجهزة.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن كفاءة اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف عبر تسريع توليد البيانات قبل السريرية للمرشحات التي تستهدف الجهاز العصبي المركزي (CNS).
- تأثير المحفظة: تتيح تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر لبرامج التحلل العصبي وعلم الأورام من خلال قراءات نمطية ظاهري أسرع وأوضح.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في علم أنسجة الأنسجة، وكيمياء الهيدروجيل، وتنفيذ بروتوكولات التحضين لإدارة عملية تحضير العينات متعددة المراحل.
- يعتمد على الحضانات الهزازة، وأنظمة غاز النيتروجين، والبيئات التي يتم التحكم في درجة حرارتها لمراحل بلمرة الهيدروجيل والترويق.
- يستلزم توحيد معايير تحضير المحاليل بين الفرق (مثل تركيزات VA-044 و SDS) وضوابط التوقيت لضمان إمكانية تكرار النتائج بين المختبرات.
- يتطلب التكيف مع الأنسجة غير التابعة للجهاز العصبي المركزي (مثل الكلى والطحال) التحقق من أوقات الترويق والحفاظ على البنية، كما هو موضح في المادة المصدر.
- قيد عملي: يتوقف نجاح البروتوكول على التنفيذ الدقيق نظرًا لمراحل التحضير المتعددة، حيث تؤدي الانحرافات إلى خطر الترويق غير المكتمل أو تلف الأنسجة.
