ميكروديلوشن مرق في المختبر الفرز: طريقة سهلة وسريعة للكشف عن المركبات المضادة للفطور جديدة

الهدف العام من هذه الطريقة هو تقييم نشاط المركبات المضادة للفطريات المحتملة ، باستخدام تعديل اختبار قابلية التخفيف الدقيق للمرق ، المستخدم في المختبرات السريرية. تستخدم هذه الطريقة لتقييم النشاط الفطري للمركبات الطبيعية أو الاصطناعية ، وهو أحد الاختبارات الأولى في تطوير العلاجات المضادة للفطريات. نحن نقدم تعليمات لفحص أولي لمضادات الفطريات الجديدة باستخدام كميات صغيرة في وقت قصير ، خاصة إذا تم إجراء التجارب باستخدام الأتمتة.

سيوضح الإجراء دانيال زاميث ميراندا ، زميل ما بعد الدكتوراه في مختبري. ابدأ هذا الإجراء عن طريق زراعة السلالات الفطرية للفحص كما هو موضح في بروتوكول النص. في اليوم التالي ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي للأنابيب المخروطية عند 1200 جم ، لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

تخلص من المادة الطافية ، وأضف عشرة ملليلتر من PBS إلى كل أنبوب ، وأعد تعليق الخلايا. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 1200 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر غسل PBS والطرد المركزي مرتين أخريين.

بعد الغسيل الثالث ، أعد تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من وسيط RPMI 1640 مزدوج القوة. اعتمادا على تعكر تعليق الخلية ، قم بإعداد مليلتر واحد من واحد إلى 100 ، أو واحد إلى 1000 ، تخفيف لكل سلالة ، في أنبوب طرد مركزي دقيق. أليكوات عشرة ميكرولترات من هذا التخفيف ، ضعه في غرفة مقياس الدم ، واحسب العدد الإجمالي للخلايا في أرباع الزوايا الأربعة تحت المجهر.

بعد حساب كثافة كل معلق خلية ، قم بإعداد معلقات خلية المخزون في وسط RPMI 1640 مزدوج القوة. تحضير 4 ، 000 خلية لكل مليلتر لسلالات المطثية البيضاء ، و 20 ، 000 خلية لكل مليلتر لسلالات C.neoformans. يتم تخزين الببتيدات المفولقة في أليكوات لمرة واحدة عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر ، ويتم إذابتها فقط في الماء منزوع الأيونات قبل كل تجربة.

يجب أن يكون تركيز الببتيد ضعف أعلى تركيز نهائي تم اختباره في الفحص. كما يتم تحضير مضادات الفطريات المرجعية. يتم إجراء الفحص المضاد للفطريات في ثلاث نسخ و 96 من ألواح البوليسترين الجيدة.

باستخدام التخفيف التسلسلي الطيني لكل ببتيد ومضاد للتحكم في الفطريات ، وحجم نهائي يبلغ 50 ميكرولتر لكل بئر. الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول هي التخفيفات التسلسلية ، لذا كن حذرا جدا خلال الخطوات القليلة التالية لتجنب أي خطأ من شأنه أن يضر بتحليلك بالكامل. باستخدام ماصة ، أضف 100 ميكرولتر من الببتيد المضاد للفطريات في تركيز القوة المزدوجة لأعلى تركيز نهائي مطلوب في الأعمدة من واحد إلى ثلاثة في الصف A. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، أضف 50 ميكرولترا من الماء المعقم إلى الآبار الأخرى في الصفوف B إلى H ، قم بإزالة 50 ميكرولتر من الآبار ذات التركيز.

انقله إلى الآبار المقابلة للتركيز التالي ، وقم بتجانس عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات. كرر التخفيف التسلسلي حتى يتم الوصول إلى الآبار ذات التركيز الأدنى ، وتخلص من 50 ميكرولترا من هذه الآبار. اترك العمودين 11 و12 من الصفوف A وB وC مع الماء فقط لعناصر التحكم الفارغة أو عناصر التحكم السلبية في النمو.

أضف 50 ميكرولترا من اللقاح المعدل بالقوة المزدوجة في وسط RPMI 1640 إلى كل بئر من الأعمدة من واحد إلى ثلاثة ، بالإضافة إلى العمود 11. سيكون التركيز النهائي ل C.albicans 2,000 خلية لكل مليلتر. سيكون التركيز النهائي ل C.neoformans 10،000 خلية لكل مليلتر.

قم بإعداد عناصر التحكم السلبية في النمو عن طريق خلط 50 ميكرولتر من الماء و 50 ميكرولتر من اللقاح المعدل بدون مضاد للفطريات. قم بإعداد أدوات تحكم فارغة عن طريق الجمع بين 50 ميكرولتر من الماء و 50 ميكرولترا من الوسط بدون خلايا. قم بتحميل أدوات التحكم في الآبار المناسبة.

راقب جميع الآبار باستخدام مجهر بصري مقلوب ، ثم احتضان الألواح عند 37 درجة مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. بعد فترة الحضانة ، راقب جميع الآبار مرة أخرى للتحقق من التغييرات في التشكل ، وكذلك للتحقق من علامات التلوث. احصل على صورة لكل لوحة باستخدام كاميرا رقمية.

في هذا الفحص التمثيلي ، تم تقييم ثلاثة ببتيدات مضادة للميكروبات ، أو AMPs ، بتركيزات تتراوح من 100 ميكرومولار إلى النقطة سبعة ثمانية ميكرومولار ، للنشاط المضاد للفطريات ضد C.neoformans. تم تضمين عنصر تحكم في النمو وفارغ. يعتبر أي بئر ذات وسائط شفافة مشابهة للآبار الفارغة نتيجة إيجابية ، في حين أن أي بئر ذات تعكر مماثل لآبار التحكم في النمو السلبية تعتبر سلبية.

نظرا لأن الحد الأدنى للتركيز المثبط ، أو MIC ، يعرف بأنه أقل تركيز مركب مضاد للميكروبات يمنع تماما نمو الفطريات المرئي في نهاية فترة الحضانة ، فإن 25 ميكرومولار يعتبر MIC ل AMP1. و 12 نقطة خمسة ميكرومولار ، الميكروفون ل AMP2. سيتعين إعادة تقييم AMP3 ، حيث نما الفطر في جميع التركيزات التي تم اختبارها.

بنفس الطريقة ، تم اختبار ثلاثة ببتيدات متميزة ضد المطثية البيضاء ، المتهم ب 50 ميكرومولار هي MIC ل AMP1. ستة ميكرومولار هي الميكروفون ل AMP2 ، و 25 ميكرومولار هي الميكروفون ل AMP3. مثال على النتيجة السيئة ، من المحتمل أن يكون من سحب العينات غير الصحيح أثناء خطوة التخفيف ، موضح بالأعمدة من خمسة إلى سبعة من الصف C في هذه اللوحة ، حيث توجد اختلافات في نمو C.neoformans بين التكرارات.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ساعتين تقريبا ، بالإضافة إلى وقت نمو الفطريات ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. تذكر أن تكون على دراية بالسمات الكيميائية الفيزيائية لهذه الجزيئات المختبرة. ثم استخدم المذيبات المناسبة كتحكم في حالة الحاجة إليها ، واستخدم الخلايا دائما في نفس مرحلة النمو.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل مقايسة قتل الوقت ، واستخدام أصباغ الجدوى ، وفحوصات ST60 للإجابة على أسئلة إضافية ، مثل ما إذا كان للمركب تأثير مبيد للفطريات أو الفطريات. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم المجهريات الطبي لاستكشاف العديد من مصادر المركبات الطبيعية أو الاصطناعية في البحث عن المركبات المضادة للفطريات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية بدء زراعة فطرية ، وإعداد الخلايا للفحص ، وإجراء التخفيفات التسلسلية ، وقراءة النتائج بعد احتضان السلالات الفطرية بمركباتنا المختبرة.

لا تنس أن العمل مع مسببات الأمراض الفطرية يمكن أن يكون خطيرا للغاية. ويجب اتخاذ التحضير مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية ، والعمل داخل غطاء السلامة البيولوجية ، واستخدام ممارسات السلامة المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.