قياس اندوريدوبليكيشن بقياس التدفق الدرنات المعزولة بروتوبلاستس

الهدف العام من هذه التجربة هو تقييم مستويات التكرار داخل درنات البطاطس. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول مورفولوجيا درنات البطاطس ، مثل مرحلة النمو التي تخضع فيها أنسجة الدرنات للتكرار. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر نتائج أكثر وضوحا مقارنة بمستحضرات قياس التدفق الخلوي النموذجية.

وسيكون باركر لايمبير الذي يعرض هذا الإجراء. طالب دراسات عليا من مختبري. بعد تحضير المحاليل والمخازن المؤقتة وفقا لبروتوكول النص ، قم بتعقيم درنات البطاطس على السطح عن طريق غمرها في 71٪ من الإيثانول لمدة خمس دقائق على الأقل.

قم بإزالة المواد النباتية من الإيثانول واتركها تجف في الهواء. قم بإعداد وتسمية أنابيب مخروطية معقمة سعة 50 مليلتر لكل عينة وتناول 15 مل من محلول حضانة تحلل البلازما المعقم بالمرشح أو PIS في كل منها. باستخدام مشرط معقم أو عينة من الفلين ، تجمد عينة ما يقرب من سنتيمتر مكعب واحد من الرغبة في تعقيم الأنسجة.

استخدم مشرط التعقيم لتقطيع الأنسجة بخشونة إلى قطع ثلاثية ملليمترات مكعبة تقريبا. ونقل الأنسجة إلى أنبوب مخروطي يحتوي على PIS. ثم احتضان الأنسجة عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.

لتوليد البروتوبلاست البطاطا ، ابدأ بإعداد وتصفية كمية مناسبة من محلول الإنزيم أو ES مع 0.71 مانيتول مولار ، وثلاثة مللي مولي كلوريد الكالسيوم ، وفوسفات أحادي البوتاسيوم واحد مليمول. كلوريد المغنيسيوم المليمولار ، 4٪ Onozuka R-10 cellulase ، 0.8٪ Macerozyme R-10 ، 1٪ hemi cellulase و 10 مللي مولار MES buffer ، درجة الحموضة 5.8. باستخدام ماصة مصلية، قم بشفط PIS من العينات الموجودة في الأنابيب.

أضف 10 ملليلتر من ES إلى كل عينة واقلب الأنابيب مرتين إلى ثلاث مرات. ثم احتضان العينات عند 29٪ مئوية و 180 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها. في اليوم الثالث ، لحصاد وغسل البروتوبلاست ، قم بإزالة العينات من شاكر واتركها تستقر لمدة 10 دقائق تقريبا.

باستخدام الماصة المصلية ، استنشق أكبر قدر ممكن من محلول ES ، مع الحرص على تجنب الأنسجة المهضومة. ثم باستخدام ماصة دقيقة وأثناء إمساك الأنبوب بزاوية ، قم بإزالة أي محلول متبقي من ES مرة أخرى مع تجنب الأنسجة المهضومة. من الأهمية بمكان إزالة أكبر قدر ممكن من محلول غسيل البروتوبلاست لتجنب تلف النوى.

قد يساعد إمساك الأنبوب بزاوية في إزالة المحلول أثناء مغادرة البروتوبلاستات. أضف 15 مل من PWS إلى كل عينة. وقلب الأنبوب برفق مرتين إلى ثلاث مرات.

اترك البروتوبلاست يستقر لمدة 10 دقائق. ثم استخدم ماصة مصلية لإزالة PWS. وماصة صغيرة لإزالة أي سائل متبقي.

مع الاحتفاظ بالعينات على الجليد ، أضف 1.5 مل من FCB المثلج البارد إلى كل أنبوب. رج كل عينة لفترة وجيزة أو دوامة لتفتيت الأنسجة المجمعة. من المهم تفتيت كتل أنسجة الدرنات حتى يتخلل FCB الخلايا بالكامل ويطلق النوى.

إذا كان سيتم إضافة عنصر تحكم بدءا من هذه الخطوة ، فاستخدم شفرة حلاقة لتقطيع ورقة صغيرة بدقة في 1.5 مل من FCB المثلج. يجب أن تكون عينات التحكم بنفس الكثافة مثل العينات التجريبية ، ويفضل أن تكون نفس النمط الجيني. أدخل أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر مع قطع الطرف وشبكة معدنية 106 ميكرومتر مذابة إلى الأسفل في أنبوب طرد مركزي صغير سعة ملليلتر.

ثم مرر ملليلتر واحد من تعليق أنسجة FCB عبر الفلتر. أضف 250 ميكرولترا من محلول الحمض النووي الريبي إلى كل عينة. ثم اقلب الأنابيب واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

أضف 125 ميكرولترا من يوديد البروبيديوم المحضر مسبقا أو محلول PI لكل عينة. اقلب الأنابيب وحضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة. استخدم العينات في أسرع وقت ممكن وفي غضون ساعتين تجنب التدهور.

قم بإنشاء مخططين نقطيين باستخدام مقياس لوغاريتمي للتشتت الأمامي مقابل التشتت الجانبي و PI مقابل التشتت الجانبي. قم أيضا بإنشاء رسم بياني باستخدام PI على المحور x. المقياس اللوغاريتمي مطلوب للتأكد من أن جميع الأحداث ضمن النطاق حيث قد تختلف النوى اختلافا كبيرا في الفلورة.

قم بتحميل أنبوب لعينة تحكم معروفة مثل أنسجة الأوراق في المختبر من عينة من النمط الجيني. واضبط الجهد بحيث تكون جميع الأحداث على نطاق واسع. قم بتدوين قناة ذروة 2C في عينة التحكم.

يجب أن تقع قمم 2C للعينات التجريبية في نفس الموقع. قم بتحميل عينة درنة تجريبية وتأكد مرة أخرى من أن جميع الأحداث على نطاق واسع. إذا كانت التعديلات مطلوبة ، كرر ضبط الجهد لعينة التحكم لتحديد قناة قمم 2C.

قم ببوابة نوى البروتوبلاست يدويا باستخدام المبعثر الجانبي مقابل مخطط PI. ثم اضبط الرسم البياني PI لإظهار منطقة نوى البروتوبلاست المسورة فقط. اجمع العدد المطلوب من الأحداث من كل عينة.

في كثير من الأحيان يستخدم الباحثون 10،000 حدث مسور لقياس التدفق الخلوي. ومع ذلك ، يتم استخدام أحداث 2000 هنا لعينات البروتوبلاست الدرناتية لاستيعاب المزيد من العينات والعينات ذات التركيزات المنخفضة. يعد توليد البروتوبلاست ضروريا لتحقيق نتائج قياس التدفق الخلوي القابلة للتكرار من درنات البطاطس.

يتم عرض التشكل العام لها هنا. يتضح الفصل بين الحمة اللب والحمة المحيطة بالنخاع بخطوط سوداء. يشار إلى حلقة الأوعية الدموية ، التي تفصل الحمة عن القشرة ، بسهم أسود.

يجب أن تكون البروتوبلاستات المعزولة كروية ومتناظرة مع غشاء البلازما سليما. لاحظ اختلاف الحجم بين البروتوبلاستات الورقية والدرنات بالإضافة إلى الاختلافات في الحجم داخل الأنسجة والتي قد تشير إلى مستويات مختلفة من التكرار. يعرض هذا الشكل التباين في النتائج التي ربما تمت مواجهتها في كل من مخططات تشتت قياس التدفق الخلوي والرسوم البيانية.

تظهر النوى السليمة فصلا نظيفا بين القمم لتحديد الوفرة النسبية للخلايا ، بينما تظهر عينات القمم المتكاملة قواعد واسعة ومتداخلة متغيرة. في مخططات التشتت المقابلة ، تشير المربعات السوداء إلى بوابة الحدث النووي للرسوم البيانية وينعكس تجميع الأحداث في عرض قمم الرسم البياني. تؤكد هذه التجربة التي تحلل مستويات التكرار أو EI النتائج السابقة التي تفيد بأن أنسجة اللب تظهر EI أعلى من أنسجة القشرة.

من المثير للدهشة أن مظهر نسيج الحمة كان مشابها للقشرة وكان أيضا مختلفا بشكل كبير عن أنسجة اللب. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على عقم العينة لأول حضانات وكذلك الاحتفاظ بالعينات على الجليد قدر الإمكان بعد تحلل البروتوبلاستات. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التلاعب الجيني من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل الجينات التي تؤثر على مستويات تكرار الدرنات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخراج البروتوبلاست من درنات البطاطس وإعدادها لقياس التدفق الخلوي للتحقق من مستويات التكرار الداخلي. لا تنس أن العمل مع يوديد البروبيديوم يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل معدات الوقاية الشخصية المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.