Name: التحليل الكمي لتعقيد أربوريزاتيون الجذعية العصبية في المورفولوجية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: تعلم تحليل تعقيد أربوريزاتيون الجذعية العصبية كمياً في ذبابة الفاكهة Drosophila لفهم دور جين SOX5 في تطور الأعصاب. هذه الطريقة تساعد الباحثين على دراسة آليات الأمراض التنكسية العصبية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نود أن أشكر إيمير ألف وليام للتصوير من المساعدة التقنية. هذا العمل كان يدعمها الصندوق "علاج مرض الزهايمر" [أن R.E.T]، "المعهد الوطني للصحة" [R01AG014713 و R01MH60009 إلى R.E.T؛ R03AR063271 و R15EB019704 إلى أ. ل.]، ومؤسسة العلوم الوطنية [NSF1455613 إلى أ. ل.].

1-إعداد التجريبية
<ol><li>إعداد الكواشف التالية: الفوسفات في دولبيكو مخزنة المالحة (PBS)؛ Triton X-100؛ 0.2 ببست % (برنامج تلفزيوني + 0.2% Triton X-100)؛ 32% بارافورمالدهيد (منهاج عمل بيجين) وتخفيفه إلى نسبة 4 في المائة قبل الاستخدام؛ سيليكون الاستومر قاعدة وعامل المعالجة؛ تركيب أنتيفادي المتوسطة (مثلاً، إطالة الذهب)؛ وظفر البولندية.</li>
	<li>إعداد المعدات التالية: مجهر التشريح، اثنان حادة ملقط ومقص ميكروديسيكشن، عدد من المسامير ميكروديسيكشن، طبق بيتري لصنع طبق التشريح وشرائح المجهر وكوفيرسليبس، مجهر [كنفوكل]، الكمبيوتر مع تركيب البرمجيات ImageJ فيجي.</li>
</ol>2. جمع اليرقات
<ol><li>ورفيقه UAS-Sox102F-[رني] الذباب مع UAS-التجارة والنقل أو ppk-GAL4 ث1118 الذباب نوع البرية، على التوالي. ثقافة الذباب في الظروف القياسية عند 25 درجة مئوية.</li>
	<li>في ~ 5-6 أيام، جمع يرقات الطور الثالث من UAS-Sox102F-[رني]/ppk-GAL4، UAS-التجارة والنقل أو UAS-التجارة والنقل، و ppk-GAL4/+ التحكم بعناية مع الملقط للتشريح.</li>
</ol>3-تشريح لليرقات
ملاحظة: يتم تشغيل كافة الإجراءات الموجودة في هذا القسم تحت مجهر ميكروديسيكتيون. التكبير ما يصل إلى المحققين. في محاولة لضبط عرض الأفق الأمثل. ويوصي بالتكبير X ~ 4-6.
<ol><li>ضع يرقة في طبق تشريح مصنوع من سيليكون الاستومر قاعدة وثقافة الأنسجة طبق بيتري.</li>
	<li>دبوس هوك فم اليرقة للسماح للجانب الظهرية مواجهة، ودبوس ثم ذيل اليرقة. ضع الجانب الظهرية في الوسط إلى أقصى حد ممكن لفضح خط الوسط، الذي سيكون علامة الانفتاح.</li>
	<li>إضافة 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني لليرقة للحفاظ على رطوبة الجسم.</li>
	<li>جعل قطع مع زوج من المقص على طول خط الوسط الظهرية بين تراتشيس اثنين، من والذيلية إلى روسترال. قم بقطع صغيرة في كل من الزوايا الأربع من جسم اليرقة.</li>
	<li>ضع رقم pin في كل من الزوايا الأربع للجسم حيث يكمن الجسم مسطح.</li>
	<li>إصلاح الجدار هيئة يرقة في 4% منهاج العمل لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>غسل في ببست لمدة 5 دقيقة كرر مرتين أكثر.</li>
	<li>قم بإزالة المسامير من الأنسجة. ثم نقل الأنسجة إلى شريحة زجاج، وتغطي مع تصاعد أنتيفادي المتوسطة، وجبل كشف الغطاء. الهواء الجاف ح 1 وختم الحواف مع البولندية ظفر.</li>
</ol>4-تجهيز التصوير
ملاحظة: تم أخذ صور باستخدام نظام مجهر مقلوب [كنفوكل]. ويمكن تصوير المستخدم العينة باستخدام هدفا X 20 (مستحسن).
<ol><li>التقاط الصور سلسلة Z. فتح مربع الحوار "التقاط سلسلة Z" في برنامج مجهر [كنفوكل]. تحديد نطاق لالتقاط الصور سلسلة Z.<ol>
<li>انقر فوق الزر "أعلى وأسفل". تحديد أعلى وأسفل بوضع وإدخال القيم إلى "أسفل:" و "أعلى:" مربعات. تعيين "خطوة" في مربع الحوار "التقاط سلسلة Z" ك 0.5 ميكرومتر. ثم انقر فوق الزر "تشغيل الآن" للحصول على صور سلسلة Z.</li>
	</ol>
</li>
	<li>حفظ الصور التي تم الحصول عليها كملفات *.tiff أو *.nd2.</li>
	<li>تخزين الشرائح في الظلام حامل في 4 درجات مئوية بعد التصوير.</li>
</ol>5-تغصن التقييم
ملاحظة: كان البروتين بروتينات فلورية خضراء overexpressed co في UAS-التجارة والنقل والذباب ppk-GAL4 في الخلايا العصبية دا للأسفار بروتينات فلورية خضراء التصوير التحليل. تم قياس كمية طولها والمتفرعة، وهيكل الخلايا العصبية دا في يرقات الطور الثالث. وتشمل تحليل معلمات طول dendrites (ميكرومتر)، المساحة السطحية (ميكرومتر2)، ومجموع عدد الفروع، وهيكل التفريع (%). ويبين الشكل 1 المعلمات التحليل بالتفصيل.
<ol><li>
طول Dendrites ملاحظة: طول dendrites هو مجموع كافة dendrites المسمى الراسم في البرنامج المساعد.<ol>
<li>إعداد وتشغيل البرمجيات20 "فيجي إيماجيج" (https://fiji.sc/). ثم تقسيم الصور إلى قنوات منفصلة، إذا كانت هناك عدة قنوات للصور. ملاحظة: الصورة في هذا البروتوكول إلا على قناة واحدة للتجارة والنقل.</li>
		<li>تشغيل "الصورة | مكدسات | المشروع Z "للحصول على إسقاط Z؛ سوف تظهر نافذة جديدة باسم 'Z-الإسقاط.' انقر فوق "كثافة كحد أقصى" لنوع الإسقاط، وتنظيم أرقام بين شريحة بدء وإيقاف الشريحة اعتماداً على التفضيلات الفردية. انقر فوق "موافق". سوف تظهر صورة Z-إسقاط تقديم إسقاطات تغصن الواضح.</li>
		<li>تتبع في نيوريتيس.<ol>
<li>حدد "الإضافات | تجزئة | بسيطة الراسم نيوريتيس "في الإطار تتبع في dendrites. تجد سوما العصبية، ومن ثم انقر فوق نقطة واحدة في تغصن بدءاً من جسم الخلية، وهناك نقطة أخرى في التلميح لهذا تغصن. ملاحظة: البرنامج سيتم توصيل النقطتين مع خط أزرق.</li>
			<li>اضغط على "Y" في إطار المكون الإضافي إذا كان المسار واضح؛ يتم تتبع المسار تغصن حتى النهاية للمسار المحدد في الصور المرئية. انقر فوق "المسار الكامل" في إطار البرنامج المساعد نفسه؛ يتم إكمال الجزء (الشكل 2). ملاحظة: بعض dendrites انتهت بعيداً عن نقاط الانطلاق، التي قسمت الطريق إلى أجزاء أصغر. كانت مجتمعة في الجزء المتعلق بتوفير مسار كامل للتتبع.</li>
		</ol>
</li>
		<li>بعد اكتمال مسار، العودة إلى نقطة جديدة فيها الفروع. المسار الجديد يمكن أن يبني على؛ سوف تظهر مربع نافذة "كافة المسارات" قيم طول جميع المسارات (الشكل 3). حفظ ملف تتبع، ومتابعة آثار لم تنته كما هو مبين في الشكل 2.</li>
		<li>تصدير بيانات الطول تغصن بالنقر فوق، "ملف | تصدير *.cvs "في نافذة' المساعد '. ثم نلخص جميع أطوال المسار، وتصدير البيانات إلى برنامج تحليل/جدول بيانات. (الشكل 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
المساحة السطحية للخلايا العصبية دا
	<ol>
<li>حدد أداة الرسم اليدوي الحر في إطار '"فيجي إيماجيج"'. تتبع المسار، ثم قم بتوصيل نقاط النهاية. من القائمة 'تحليل'، حدد "تعيين قياسات | المنطقة. " انقر فوق "قياس" من القائمة 'تحليل'. تظهر النتيجة في مربع جديد مع القيمة لمنطقة محددة (الشكل 4). قم بنسخة إلى برنامج تحليل البيانات.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
إجمالي عدد الفروع وهيكل المتفرع من الخلايا العصبية دا
	<ol>
<li>حساب إجمالي عدد الفروع بفتح "التحليل"، ثم "تجعل | تحليل مسارات سكيليتونيزيد "في إطار البرنامج المساعد للبحث عن المفقودين (الشكل 5). ملاحظة: بنية أربور هي مجموع مستويات فروع. تم تعريف المسار بين خلايا الجسم ونصائح تغصن، ويمكن أن يتضمن المسار واحد فروع متعددة، مثل العرش الأولية هي dendrites من جسم الخلية العصبية. العرش الثانوي فروع من المرحلة الابتدائية مع العرش رباعي، وكويناري في التعليم العالي، وهلم جرا. يتم فصل هيكل تغصن التفريع تبعاً لمستويات فروع. على سبيل المثال، % الأساسي هو عدد الفروع مقسمة حسب العدد الإجمالي التفريع، وهلم جرا.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wassle, H., Boycott, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of the mammalian retina.</a> Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).</li>
<li>MacNeil, M. A., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+diversity+among+amacrine+cells%3A+implications+for+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Extreme diversity among amacrine cells: implications for function.</a> Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).</li>
<li>Losonczy, A., Makara, J. K., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+dendritic+plasticity+and+input+feature+storage+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized dendritic plasticity and input feature storage in neurons.</a> Nature. 452 (7186), 436-441 (2008).</li>
<li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons%3A+dendritic+structure+and+synaptic+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (3), 206-221 (2008).</li>
<li>Jaworski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+microtubules+regulate+dendritic+spine+morphology+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity.</a> Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).</li>
<li>Kweon, J. H., Kim, S., Lee, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+basis+of+dendrite+pathology+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">The cellular basis of dendrite pathology in neurodegenerative diseases.</a> BMB Rep. 50 (1), 5-11 (2016).</li>
<li>Baloyannis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+pathology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Dendritic pathology in Alzheimer's disease.</a> J Neurol Sci. 283 (1-2), 153-157 (2009).</li>
<li>Masliah, E., Terry, R. D., Alford, M., DeTeresa, R., Hansen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+and+subcortical+patterns+of+synaptophysinlike+immunoreactivity+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cortical and subcortical patterns of synaptophysinlike immunoreactivity in Alzheimer's disease.</a> Am J Pathol. 138 (1), 235-246 (1991).</li>
<li>Wayman, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dendritic+arborization+mediated+by+CaM-kinase+I+activation+and+enhanced+CREB-dependent+transcription+of+Wnt-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2.</a> Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).</li>
<li>Rosso, S. B., Sussman, D., Wynshaw-Boris, A., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+through+Dishevelled%2C+Rac+and+JNK+regulates+dendritic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling through Dishevelled, Rac and JNK regulates dendritic development.</a> Nat Neurosci. 8 (1), 34-42 (2005).</li>
<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+levels+of+the+homeodomain+protein+cut+regulate+distinct+dendrite+branching+patterns+of+Drosophila+multidendritic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons.</a> Cell. 112 (6), 805-818 (2003).</li>
<li>Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+morphological+diversity+of+dendrites+in+Drosophila+by+the+BTB-zinc+finger+protein+abrupt%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt.</a> Neuron. 43 (6), 809-822 (2004).</li>
<li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+out%3A+mechanisms+of+dendritic+arborization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li>
<li>Sears, J. C., Broihier, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+regulates+microtubule+dynamics+and+polarity+to+promote+dendrite+branching+in+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">FoxO regulates microtubule dynamics and polarity to promote dendrite branching in Drosophila sensory neurons.</a> Dev Biol. 418 (1), 40-54 (2016).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+the+Drosophila+ortholog+of+SOX5+leads+to+abnormal+neuronal+development+and+behavioral+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 leads to abnormal neuronal development and behavioral impairment.</a> Hum Mol Genet. 26 (8), 1472-1482 (2017).</li>
<li>Misra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genome-Wide+Screen+for+Dendritically+Localized+RNAs+Identifies+Genes+Required+for+Dendrite+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">A Genome-Wide Screen for Dendritically Localized RNAs Identifies Genes Required for Dendrite Morphogenesis.</a> G3 (Bethesda). 6 (8), 2397-2405 (2016).</li>
<li>Emoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+dendritic+branching+and+tiling+by+the+Tricornered-kinase%2FFurry+signaling+pathway+in+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of dendritic branching and tiling by the Tricornered-kinase/Furry signaling pathway in Drosophila sensory neurons.</a> Cell. 119 (2), 245-256 (2004).</li>
<li>Olesnicky, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+use+of+RNA-binding+proteins+in+Drosophila+sensory+neuron+dendrite+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Extensive use of RNA-binding proteins in Drosophila sensory neuron dendrite morphogenesis.</a> G3 (Bethesda). 4 (2), 297-306 (2014).</li>
<li>Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+bantam+functions+in+epithelial+cells+to+regulate+scaling+growth+of+dendrite+arbors+in+drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).</li>
<li>Jinushi-Nakao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knot%2FCollier+and+cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).</li>
<li>Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+multidendritic+neuron+differentiation+in+Drosophila%3A+the+role+of+Collier%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier.</a> Dev Biol. 315 (1), 232-242 (2008).</li>
<li>Copf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+gene+dosage+in+controlling+dendritic+arbor+formation+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Importance of gene dosage in controlling dendritic arbor formation during development.</a> Eur J Neurosci. 42 (6), 2234-2249 (2015).</li>
<li>Rosso, S. B., Inestrosa, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNT+signaling+in+neuronal+maturation+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">WNT signaling in neuronal maturation and synaptogenesis.</a> Front Cell Neurosci. 7, 103(2013).</li>
<li>Engel, T., Hernandez, F., Avila, J., Lucas, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+reversal+of+Alzheimer%27s+disease-like+phenotype+in+a+mouse+model+with+conditional+overexpression+of+glycogen+synthase+kinase-3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Full reversal of Alzheimer's disease-like phenotype in a mouse model with conditional overexpression of glycogen synthase kinase-3.</a> J Neurosci. 26 (19), 5083-5090 (2006).</li>
<li>Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Neurite+Tracer%3A+open+source+software+for+reconstruction%2C+visualization+and+analysis+of+neuronal+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes.</a> Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).</li>
<li>Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuriteTracer%3A+a+novel+ImageJ+plugin+for+automated+quantification+of+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth.</a> J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Dendrites التي يعصب البشرة مناطق الإدخال من الخلايا العصبية، ومورفولوجيس على تحديد كيفية تلقي المعلومات ومعالجتها بواسطة الخلايا العصبية الفردية. ويعكس التنمية تغصن مورفولوجيا التحوير الجيني للمنظمة تغصن. العصبية دا اليرقات المورفولوجية للجهاز العصبي المحيطي نموذجا هاما لدراسة التنمية تغصن سبب: 1) التشابه الوظيفي مع الثدييات11،12؛ 2) الطبقة أربعة أوجه التمييز استناداً إلى هيكل تغصن11،12؛ و 3) الع...

Dendrites، وهي إسقاطات متفرع من خلية، تغطي الحقل الذي يشمل مدخلات العصبية الحسية ومتشابك من1،الخلايا العصبية الأخرى2. تعد مكوناً هاما لتشكيل المشبك dendrites وتلعب دوراً حاسما في إدماج المدخلات متشابك، فضلا عن الترويج لتحفيز الكهروكيميائية في خلية. أربوريزيشن الجذعية (دا) هي عملية التي تشكل الخلايا العصبية الأشجار الجذعية جديدة وفروع لإنشاء نهايات جديدة. التنمية ومورفولوجيا دا، مثل أنماط التجميع، وكثافة فرع نتيجة الخطوة متعددة العمليات البيولوجية وهي ارتباطاً وثيقا بالوظيفة العصبية. والهدف من هذا البروتوكول توفير وسيلة للتحليل الكمي لتعقيد أربوريزاتيون ديندريتريك الخلايا العصبية في المورفولوجية.
تعقد dendrites يحدد أنواع متشابك والاتصال، ومدخلات من الخلايا العصبية شريك. أنماط التفريع وكثافة dendrites تشارك في معالجة الإشارات التي تتلاقى على3،حقل الجذعية4. Dendrites تتمتع بالمرونة للتكيف في مجال التنمية. على سبيل المثال، يشير متشابك له تأثير على المنظمة تغصن في العصبية somatosensory خلال مرحلة النمو و النضج العصبي5. إنشاء اتصال الخلايا العصبية تعتمد على morphogenesis ونضوج dendrites. تشوه dendrites مقترن تلف في وظيفة الخلايا العصبية. وقد أظهرت الدراسات أن شذوذ morphogenesis العصبية دا قد يسهم في مسببات أمراض الأعصاب متعددة، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD)، ومرض باركنسون (PD)، مرض هنتنغتون (HD)، ولو جيهريج المرض/ التصلب العضلي الجانبي (المرض)6،،من78. تظهر التعديلات متشابك في المرحلة المبكرة من الإعلان، بالتضافر مع انخفاض وضعف العصبية الدالة7،8. بيد أن التفاصيل المتعلقة بكيفية إسهام علم الأمراض تغصن المرضية في هذه الأمراض الأعصاب لا يزال بعيد المنال.
وينظم وضع dendrites الجينات ترميز شبكة معقدة من المنظمين، مثل الأسرة Wnt البروتينات9،10، وعوامل النسخ ويغاندس على مستقبلات سطح الخلية11،12 . المورفولوجية دا الخلايا العصبية تتكون من أربعة فصول (الفصل الأول والثاني الثالث، الرابع)، من الفئة التي الرابع دا الخلايا العصبية الأكثر تعقيداً في أنماط التفريع وقد استخدمت كنظام تجريبي قوية لتحسين فهم morphogenesis13، 14. خلال أوائل morphogenesis، overexpression و/أو [رني] إسكات الجينات في الصف الرابع دا الخلايا العصبية تؤدي إلى تغيرات في أنماط التفريع وتغصن التقليم13. من المهم وضع طريقة عملية للتحليل الكمي من أربوريزيشن الجذعية العصبية.
وقد أظهرنا سابقا أن إسكات أورثولوج المورفولوجية من SOX5، Sox102F، أدى إلى أقصر dendrites من الخلايا العصبية دا وتقليل التعقيد في الصف الرابع دا الخلايا العصبية15. نقدم هنا، إجراء تحليل كمي لمدى تعقيد أربوريزيشن الجذعية العصبية (نداك) في المورفولوجية. يوفر هذا البروتوكول، مقتبس من وصف المنهجية السابقة، أسلوب مختصر للاعتداء تنمية الخلايا العصبية الحسية دا. فإنه يوضح صورة قوية العلامات والعصبية دا في الثالثة الطور اليرقات جدار الجسم16،17،،من1819. هو بروتوكول قيماً للباحثين الذين يرغبون في التحقيق في نداك والفوارق التنموية في فيفو.

<table><tbody><tr><td>محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)</td> <td>جيبكو لعلوم الحياة</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td> <td>علوم المجهر الإلكتروني</td><td>15714-S</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 قاعدة مطاط أساطي السيليكون وعامل المعالجة</td><td>Dow Corning Corportation</td><td>3097366-0516 ؛ 3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>ProLong الذهب المضاد للتلاشي جبل</td><td>ثيرمو فيشر العلمي</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>طلاء الأظافر&nbsp;</td><td>CVS</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>مجهر ستيريو</td><td>نيكون</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>مجهر متحد البؤر</td><td>نيكون</td><td>Eclipse Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>بتري طبق</td><td>فالكون</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>ملقط</td><td>دومون</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>مقص &nbsp;</td><td>Roboz Surgical Instrument Co</td><td>RS-5611</td><td></td></tr><tr><td>دبابيس الحشرات &nbsp;</td><td>Roboz Surgical Instrument Co</td><td>RS-6082-25</td><td></td></tr><tr><td>شرائح مجهر وزلات غطاء</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>15-188-52</td><td></td></tr></tbody></table>

التحليل الكمي لتعقيد أربوريزاتيون الجذعية العصبية في المورفولوجية

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites الإسقاطات متفرع من خلية ومورفولوجيا الجذعية يعكس المنظمة متشابك أثناء تطوير النظام العصبي. المورفولوجية اليرقات أربوريزيشن الجذعية العصبية (دا) نموذج مثالي لدراسة morphogenesis dendrites العصبية ووظيفة الجينات في تطوير الجهاز العصبي. وهناك أربع فئات من الخلايا العصبية دا. الفئة الرابعة هي الأكثر تعقيداً مع نمط المتفرعة التي تغطي المنطقة بأكملها تقريبا من الجدار الجسم اليرقات. نحن تميزت سابقا أثر إسكات أورثولوج المورفولوجية ل SOX5 على الدرجة الرابعة أربوريزيشن الجذعية العصبية التعقيد (نداك) باستخدام المعلمات الأربعة: طول dendrites، والمساحة السطحية لتغطية تغصن، إجمالي عدد الفروع، وهيكل التفريع. ويقدم هذا البروتوكول سير العمل من نداك التحليل الكمي، تتألف من تشريح اليرقات والفحص المجهري [كنفوكل]، وإجراءات تحليل الصورة باستخدام البرمجيات إيماجيج. سيتم تحسين الفهم لوظيفة الخلايا العصبية مزيد من التبصر في دا العصبية التنمية وآلياتها الأساسية وتقديم أدلة حول الأسباب الأساسية للجهاز العصبي والاضطرابات النمائية.

كانت تعتبرها dendrites من الخلايا العصبية دا بروتينات فلورية خضراء co overexpressing (UAS-التجارة والنقل؛ ppk-GAL4) في سوما دا العصبية والعرش الجذعية للأسفار بروتينات فلورية خضراء التصوير التحليل. وكان تصويرها مورفولوجية dendrites العصبية دا قبل مجهر مقلوب [كنفوكل] (الشكل 2).
تعود dendrites من الخلايا العصبية دا استخدام البرمجيات ImageJ فيجي. استخدم الملف لتقدير طول تغصن (الشكل ...

هذا البروتوكول يركز على التحليل الكمي لتعقيد أربوريزيشن الجذعية العصبية (نداك) في المورفولوجية، التي يمكن استخدامها لإجراء دراسات ل morphogenesis الجذعية.

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة تأثير الجين SOX5 على تعقيد الخلايا العصبية التشعب خلال تطور الخلايا العصبية في دروسوفيليا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في دراسة تكوين المورفين من التشعبات العصبية ، ووظيفة الجينات في تطوير الجهاز العصبي ، لفهم أفضل لجينات الأمراض العصبية التنكسية. في نهاية المطاف يوفر هذا الأسلوب تحليل كمي لتشعب التعقيد، والتي يمكن استخدامها في العديد من أنواع مختلفة من تشعبات الأعصاب.تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو الآلية الوراثية للمرض العصبي التنكسي، لأن الطفرة تحمل المفتاح لفهم وظيفة الجينات. إعداد الصلبان من UAS-GFP؛ ppk-GAL4 مع UAS-Sox102F-RNAi سلالة الذباب أو الضوابط W118. ثقافة يطير تحت شروط معياريّة في 25 درجة مئويّة.في حوالي خمسة إلى ستة أيام ، استخدم ملقط لجمع اليرقات الثالثة بعناية للتشريح. ضع يرقة في طبق تشريح مصنوع من قاعدة مليستومر السيليكون ، وطبق بيتري من الأنسجة. ثم ضع الطبق تحت مجهر التشريح.الآن دبوس ذيل اليرقة لفضح خط الوسط. ثم قم بربط خطاطيف فم اليرقة حتى يصل الجانب الظهري لليرقة. الآن إضافة 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني إلى الطبق لتزج اليرقة في الحل.بعد ذلك ، قطع ذيل فم اليرقة بشقوق صغيرة. ثم قطع اليرقة مفتوحة على طول خط الوسط الظهري وبين القصبة الهوائية اثنين، الانتقال من السد إلى الروسترال. ثم وضع دبوس في كل من الزوايا الأربعة من الجسم حتى الجسم يكمن شقة.الآن إصلاح جدار الجسم يرقة في أربعة في المئة PFA لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم غسل اليرقة مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل غسل. بعد غسل، وإزالة دبابيس ونقل الأنسجة على شريحة زجاجية.ثم تزج الأنسجة في antifade تصاعد المتوسطة، وجبل مع زلة الغطاء. السماح للأنسجة التي شنت على الهواء الجاف لمدة ساعة قبل الختم على زلة الغطاء مع طلاء الأظافر. تخزين هذه الشرائح في الظلام في أربع درجات مئوية.التقاط الصور سلسلة ض مع مجهر confocal باستخدام هدف 20X. أولاً، قم بتعيين نطاق الخطوات z لتشمل جميع الخلايا العصبية DA في جدار جسم اليرقة، وتعيين حجم الخطوة إلى نصف ميكرومتر. ثم تخزين الصور كملفات TIF أو ND2 للمعالجة.بعد ذلك، تقييم عدد ومورفولوجيا التشعبات على الخلايا العصبية DA. تبدأ مع تقييم أطوالها. أولاً، في فيجي إيمج، قم بتقسيم الصور إلى قنوات منفصلة إذا لزم الأمر.ولا يحتاج التقييم إلا إلى تقييم قناة البرنامج العالمي. المقبل، وجعل الإسقاط z. في النافذة الجديدة، حدد أقصى كثافة لنوع العرض، واختر شرائح البداية والتوقّف.ثم انقر فوق موافق لإنتاج صورة الإسقاط ض مع توقعات dendrite واضحة. الآن تتبع neurites باستخدام أداة المكونات في. أولاً، انتقل إلى سوما من الخلايا العصبية من الفائدة وانقر حيث يُظهر تشعب واحد من جسم الخلية.ثم انقر على طرف هذا التشعب. إذا كان الخط الأزرق الذي يربط بين نقطتين يمتد طول neurite، اضغط Y نعم. ثم إذا كان هذا الخط يناسب المسار الكامل لل neurite، انقر فوق المسار الكامل.إذا كان الخط لا يتناسب مع المسار، ثم انقر على نقاط أخرى على طول هذا neurite لثني المسار في شرائح خط متعددة من شأنها أن تناسب طول neurite. ثم، انقر فوق المسار الكامل والمضي قدما في وضع علامة على المسار ل neurite المقبل. بعد إكمال كافة مسارات التتبع، حدد الخيار تحليل، قياس المسارات لتصدير المسارات إلى ملف CSV.استخدم هذه البيانات لحساب متوسط قيمة أطوال المسار للتحليل. بعد ذلك، حساب مساحة السطح من الخلايا العصبية. أولاً، حدد أداة الرسم اليدوي الحر من نافذة Fiji ImageJ.ثم، ربط نقاط نهاية من الخلايا العصبية من الفائدة. ثم، حدد الخيار قياس من إطار تحليل. تظهر النتيجة في مربع جديد مع تحديد قيمة المنطقة.نسخ هذه القيمة إلى برنامج تحليل البيانات. وأخيرا ، حساب العدد الإجمالي الفروع باستخدام تحليل الهيكل العظمي المسارات البرنامج المساعد. تم تسمية dendrites من الخلايا العصبية DA من قبل المشاركة في التعبير عن GFP في سوما وتشعب arbors لتحليل التصوير الفلوريس GFP.تم تصوير مورفولوجيا التشعب باستخدام مجهر مقلوب. تم تتبع dendrites من الخلايا العصبية DA كما هو موضح. تم استخدام الملف لتقدير طول التشعب.أدى إسكات Sox102F في الخلايا العصبية DA في يرقة النجوم الثالثة إلى انخفاض كبير في العدد الإجمالي للتشعبات مع حوالي نصف طول الفرع وبنية أبسط ، مما يظهر فقط نصف عدد الفروع. منطقيا، أدى هذا إلى انخفاض في مساحة سطح arbor. يوفر هذا البروتوكول طريقة سريعة لتقييم تطور الخلايا العصبية الحسية DA.أثناء محاولة هذا الإجراء, تأكد من اتخاذ عدد وفير من الصور لكل مجموعة من الخلايا العصبية DA للحصول على تغطية جيدة. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تحليل التشعب من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول تطوير التشعب. منذ أن تطور، ساعدت هذه التقنية الباحثين في مجال علم الأعصاب على استنتاج الأمراض العصبية مثل الزهايمر باستخدام أنظمة النماذج.

quantitative-analysis-neuronal-dendritic-arborization-complexity

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

وقد حددت الدراسات التي أجريت مؤخرا العديد من الطفرات في البروتينات المرتبطة متشابك أمراض الدماغ. الابتدائية العصبونات القشرية مثقف توفر مرونة كبيرة في دراسة الآثار المترتبة على هذه البروتينات المرتبطة بمرض في العمود الفقري شجيري التشكل والحركة.

تحليل الصرف العمود الفقري شجيري الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي لؤلؤ

الخلايا العصبية الحسية تشجر شجيري...

تحليل الصرفي ذبابة الفاكهة اليرقات المحيطية الانشعابيات عصبون حسي والمحاوير استخدام الفسيفساء الوراثية

المصدر: Ting، C.، et al.، تحليل مورفولوجيا الشجيرات في الأعمدة والطبقات. J. Vis. Exp. (2017)يوضح هذا الفيديو إجراء إعداد ذبابة الفاكهة ، والتقاط مداخن الصور الأفقية والأمامية لتشعبات النخاع المسماة GFP تحت مجهر متحد البؤر ، وإنشاء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لتحليل مورفولوجيتها عبر الطبقات والأعمدة.

تحليل مورفولوجيا الشجيرات عبر ذبابة الفاكهة طبقات وأعمدة النخاع

نصف طريقتين لتصور وقياس الأشجار الشجيرية في الحصين لنماذج الفئران: الوقت الحقيقي والعمق الممتد للتصوير الميداني. في حين أن الطريقة الأولى تسمح بالتتبع الطبوغرافي المتطور والقياس الكمي لمدى التفرع ، فإن الأخيرة تسمح بالتصور السريع للشجرة المتغصنة.

تقييم شجيري تشجر في التلفيف المسنن من منطقة الحصين في الفئران

تفيد الدراسات التشكل الخلايا العصبية باستخدام ذبابة الفاكهة تشجر شجيري اليرقات (دا) الخلايا العصبية من في التصور الموقع من البروتينات العصبية والبشرة المناعي. نحن تصف الإجراء الذي يحسن التحليل المناعي دا الخلايا العصبية والخلايا المحيطة البشرة عن طريق إزالة الأنسجة العضلية من جدار الجسم اليرقات.

إزالة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأنسجة العضلية من اليرقات شرائح التحليل المناعي من العصبونات الحسية وخلايا البشرة

نحن هنا تظهر كيفية تحديد عدد والتوزيع المكاني للمناطق نشطة متشابك في المستقبلات الضوئية البطن ذبابة الفاكهة، سلط الضوء مع الواسمات الجزيئية المشفرة وراثيا، وتعديل على بعد التعرض لفترات طويلة للضوء.

تحليل متشابك التحوير من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء بعد التعرض للضوء لفترات طويلة

تم إنشاء اثنين من خوارزميات تحليل الصور، "ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics" و "ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics"، لتحديد تسعة الميزات المورفولوجية للذبابة الفاكهة الوصل العصبي العضلي (NMJ) تلقائيا.

اثنين من الخوارزميات لإنتاجية عالية ومتعدد حدودي الكمي ل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; عصبي عضلي مفرق الصرف

هنا، وتبين لنا كيفية تحليل التوجيه شجيري من الخلايا العصبية النخاع ذبابة الفاكهة في الأعمدة وطبقات. يتضمن سير العمل تقنية التصوير المزدوج بغية تحسين جودة الصورة والأدوات الحاسوبية لتعقب وتسجيل العرش الجذعية لمجموعة عمود إشارة ولتحليل الهياكل الجذعية في الفضاء 3D.

تحليل الجذعية الصرف في الأعمدة والطبقات

هنا نقدم بروتوكول جولجي-كوكس في التفاصيل واسعة النطاق. هذا الأسلوب موثوقة وصمة عار النسيج يسمح لتقييم ذات جودة عالية من الهندسة المعمارية الخلوية في الحصين، وفي جميع أنحاء الدماغ بأكمله، مع الحد الأدنى من استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

تقييم التعقيد الجذعي الحصين في الفئران المسنين باستخدام طريقة جولجي-كوكس

هنا، نقوم بوصف الطريقة التي استخدمناها لتصوير فيلوبوديا الددرية المنوية في إعداد مباشر لدماغ اليرقات دروسوفيلا، والبروتوكول الذي قمنا بتطويره لتحديد مجموعات بيانات التصوير ثلاثي الأبعاد الفاصلة زمنياً للتقييمات الكمية للدندريت ديناميات في تطوير الخلايا العصبية.

الفاصل الزمني التصوير الحي والقياس الكمي لديناميات فرع التقشر السريع في تطوير الخلايا العصبية Drosophila

تعلم تحليل تعقيد أربوريزاتيون الجذعية العصبية كمياً في ذبابة الفاكهة Drosophila لفهم دور جين SOX5 في تطور الأعصاب. هذه الطريقة تساعد الباحثين على دراسة آليات الأمراض التنكسية العصبية.

التحليل الكمي لتعقيد أربوريزاتيون الجذعية العصبية في المورفولوجية

استكشف المزيد من الفيديوهات