تحديد إذا كان الحمض النووي ملطخة "سينين صبغ يمكن هضمها" مع إنزيمات التقييد

الهدف العام من هذه التجربة هو هضم جزيئات الحمض النووي المصنفة بالفلورسنت مع إنزيمات التقييد الحساسة للمثيلة وغير الميثيلة وتحديد معدل هضم التجربة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات الكيمياء أو علم الأحياء ، مثل علم الجينوم. تتمثل ميزة هذه الطريقة في أنه يمكن للعالم هضم الحمض النووي الملون مسبقا باستخدام إنزيم لتحديد ما إذا كان الحمض النووي كامل الطول بعد الانتهاء من تجربة مختلفة.

سيوضح الإجراء درو طومسون ، طالب جامعي من مختبري. لصنع جل أغروز 0.7٪ ، قم بوزن 1.4 جرام من الاغاروز بدرجة حرارة التبلور العالية في قارورة إرلينماير. ثم أضف 200 مل من 1x TAE المؤقت وضع دورق مقلوب فوق القارورة.

سخني المحلول على طبق ساخن حتى تبدأ الفقاعات في التكون في قاع القارورة وتطفو إلى الأعلى. أخرجي المحلول من اللوح الساخن واتركيه يبرد حتى يمكن لمس القارورة باليد العارية. ثم صب الجل في قالب هلام 24.5 سم × 21.8 سم مع مشط جل لإنشاء آبار.

استخدم طرف الماصة لتفجير الفقاعات بالقرب من المشط أو على سطح الجل واترك الجل يتجمد لمدة 15 دقيقة على الأقل. لتلطيخ حمض نوال لامدا بستة تركيزات مختلفة من الأصباغ ، ابدأ باستخدام 1x TE لتحضير 300 ميكرولتر من 100 نانوجرام لكل ميكرولتر من حمض نووي لامدا. قم بتخزين المحلول على أربع درجات مئوية.

أثناء تحضير عينة لكل تركيز من تركيزات الصبغة التالية لكل نطاق متوقع في ملخص تقييدي ، قم بتلطيخ 75 إلى 100 نانوجرام من حمض نوال لامدا غير الميثيل. احتضان العينات عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، لتحديد ما إذا كان إنزيم التقييد يمكنه هضم الحمض النووي الملون ، أضف 20 وحدة من إنزيم التقييد ، وثلاثة ميكرولترات من المخزن المؤقت المناسب بأعلى كفاءة في القطع ، والماء المقطر المعقم والمفلتر لتفاعل 30 ميكرولتر.

ضع التفاعلات في حمام مائي في النشاط الأنزيمي الأمثل واحتضنها لمدة ساعتين إلى أربع ساعات. ثم أوقف التفاعلات بإضافة ميكرولترين من 0.5 مولي EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0. قم بإزالة الجوانب من قالب الجل المعد مسبقا وضع الجل في صندوق الرحلان الكهربائي للهلام.

صب 2.5 لتر من 1x TAE buffer في الصندوق. ثم قم بإزالة مشط الجل بعناية من الجل حتى يمكن الوصول إلى الآبار. ماصة تفاعلات إنزيم التقييد على غشاء بلاستيكي ، ولكل محلول تفاعل ، أضف ميكرولتر واحد من صبغة التحميل 6x لكل خمسة إلى ستة ميكرولتر من محلول الحمض النووي.

ثم ماصة التفاعلات في الآبار. امزج ميكرولتر واحد من سلم كيلو قاعدة واحد ، وتسعة ميكرولتر من 1x TE ، وميكرولترين من صبغة التحميل 6x. ثم قم بتحميل المحلول في الآبار التي تحيط بالحلول الأخرى.

قم بتغطية صندوق الجل بورق أو قماش أزرق داكن أو أسود ، ثم قم بتوصيل صندوق الجل بمصدر طاقة. اضبط مصدر الطاقة على 30 فولت وقم بتشغيله طوال الليل. أطفئ الأنوار أثناء تشغيل الجل لمنع الانقسام الضوئي للحمض النووي المسمى.

في صباح اليوم التالي ، انقل الجل الموجود في الدرج إلى وعاء به 45 ميكرولتر من بروميد الإيثيديوم ولتر واحد من 1x TAE عازلة. قم بتخزين الحاوية في درجة حرارة الغرفة في الظلام أو قم بتغطيتها بورق الألمنيوم لمنع التعرض للضوء. اترك الجل لمدة 45 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.

لتصوير الجل ، ضع الجل فوق مصباح الضوء الأزرق ، والذي ينبعث منه أقصى ناتج للضوء بين 400 إلى 500 نانومتر. التقط صورا بكاميرا متصلة بالمحطة. حدد معدل الهضم للتجربة وفقا لبروتوكول النص.

يتم تحديد كفاءة الإنزيم بقسمة العدد الإجمالي للنطاقات المتوقعة على عدد النطاقات المرئية. بالإضافة إلى ذلك ، من أجل تحديد الحجم التقريبي للنطاقات ، يلزم وجود عنصر تحكم لمعرفة المكان المتوقع أن تكون جزيئات الحمض النووي الأصلية مقارنة بالحمض النووي الملطخ. انخفضت حركة العصابات في الممرات الثالثة والرابعة ، مما تسبب في تحول العصابات بالقرب من الآبار.

في هذه الممرات ، لا تؤثر كمية الصبغة بشكل ملحوظ على التنقل ، وبالتالي فإن العصابات تتطابق مع التحكم. يظهر الممران الخامس والسادس نطاقات أكثر من عنصر التحكم ، مما يشير إلى الهضم الجزئي ، مما يشير إلى أن الأصباغ المتأثرة بالانقسام في مواقع التعرف. في هذه التجربة ، تظهر جميع النطاقات المتوقعة لجميع تركيزات الصبغة ، لذلك لم يتداخل النرد مع هضم الحمض النووي.

لمعرفة كيف تغيرت الحركة مع زيادة تركيز صبغة YOYO-1 ، تم إدخال علامات نجمية ملونة بجوار كل شريط. على سبيل المثال ، تحتوي النطاقات التي يبلغ وزنها 3.5 كيلو قاعدة على علامات نجمية حمراء بجانبها في كل تركيز YOYO-1. العصابات غير المتوقعة في الممرات الخامسة والسادسة ليس لها علامة نجمية بجوار العصابات.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تغطية الجل بقطعة من الورق الداكن وإكمال تشغيل الجل في غرفة مظلمة. تأكد أيضا من استخدام الأنابيب الداكنة لردود أفعالك. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية هضم جزيئات الحمض النووي الملطخة بالفلورسنت باستخدام إنزيمات التقييد وتحديد معدل هضم التفاعل.

لا تنس أن العمل مع بروميد الإيثيديوم يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، لذلك يجب اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات ونظارات السلامة أثناء تنفيذ الإجراء. تأكد أيضا من ارتداء نظارات السلامة المناسبة عند استخدام جهاز إضاءة عازل.