الأمثل للتحليل متعدد التعبير المستندة إلى الجيش الملكي النيبالي استخدام المواد الأرشيفية سرطان الثدي

تم تحسين هذه الطريقة بنجاح لتصنيف مرضى سرطان الثدي إلى مجموعات علاجية معروفة وغير معروفة. تحدد الحساسية العالية لهذا الاختبار العينات غير المتجانسة التي يمكن دراستها بشكل أكبر باستخدام التشريح المجهري بالليزر. تتمثل الميزة الرئيسية لمقايسة تعدد الإرسال المستندة إلى الحمض النووي الريبي في قابلية تكرار النتائج باستخدام مادة أرشيفية مدمجة بالبارافين مثبتة بالفورمالين الملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوسين مما يسمح بمخرجات عالية الدقة والتحقق من صحة المؤشرات الحيوية.

تحضير الأنسجة كما هو موضح في البروتوكول النصي. لبدء التشريح ، قم بتعيين حدود الشريحة ومعايرة حركة المسرح للمجهر. الآن امسح شرائح الغشاء الملون باستخدام هدف 4X.

حدد المناطق المستهدفة وأطاحتها للتشريح الدقيق على شريحة الغشاء. تتبع المساحة الإجمالية. هناك حاجة إلى 42 ملم مربع على الأقل لتحليل الحمض النووي الريبي النهائي الكافي.

ثم ابدأ القطع بالليزر في المعلمات المحددة. بعد ذلك ، استخدم آلية رفع الغطاء لاسترداد القسم المفصل وتعيين القسم على غطاء الناشر لأنبوب مسمى متصل بملحق ميكانيكي. إذا لم يتم استرداد القسم المقطوع على الغطاء ، فكرر تشريح المنطقة المستهدفة.

دقة التشريح الدقيق خطوة حاسمة ويجب على المرء دائما التأكد من أن منطقة التشريح الدقيق الموجودة على الغطاء تتزامن مع الصورة المميزة والممسوحة ضوئيا. اجمع أكبر عدد ممكن من أقسام الأنسجة حسب الرغبة ، كل منها في أنبوب منفصل ، ثم تابع تحلل عينات الأنسجة. للتحلل ، ضع 2.4 ميكرولتر من محلول التجانس قبل ملليمتر مربع من مساحة الأنسجة في كل عينة ، ثم قم بتدوير العينات لمدة 10 ثوان بأقصى سرعة.

بعد ذلك ، قم بتدوير العينات لمدة خمس ثوان عند 2 ، 500 جم. ثم انقل العينات إلى أنابيب سعة 1.5 ملليلتر إذا لزم الأمر ، وضعها في كتلة تسخين مهتزة عند 65 درجة مئوية. رجهم عند 600 دورة في الدقيقة لمدة 12 إلى 18 ساعة.

ثم الطرد المركزي للمحللات عند 21،000 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. اجمع المادة الطفية الصافية بعناية في أنبوب جديد مسمى. تجنب نقل أي شظايا أنسجة.

يمكن تخزين المواد الطافية عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد تحضير جميع الكواشف للفحص القائم على التهجين ، قم بتحميل ما يصل إلى 90 بئرا من صفيحة الفصل المغناطيسي المكونة من 96 بئرا مع 25 ميكرولتر من الأنسجة المتجانسة. قم بتحميل 25 ميكرولترا من عينات التحكم في ثلاثة آبار مخصصة وقم بتحميل محلول تجانس سعة 25 ميكرولتر في ثلاثة آبار كفراغات.

ثم أغلق لوحة الفصل المغناطيسية باستخدام مانع تسرب ضغط بلاستيكي شفاف وضع اللوحة في حاضنة 54 درجة مئوية لمدة 18 إلى 22 ساعة مع الرج. في اليوم التالي ، قم بتركيب اللوحة وقفلها على غسالة لوحة مغناطيسية محمولة باليد ، ثم قم بإزالة ختم الضغط وانتظر دقيقة واحدة حتى تستقر الخرزات المغناطيسية. الآن قم بغسل.

صفي اللوحة فوق الحوض واستخدمي مناديل ورقية لتجفيفها برفق ، ثم قم بتحميل جميع الآبار ب 100 ميكرولتر من محلول الغسيل 1X وانتظر 15 ثانية. كرر هذه العملية ثلاث مرات لإكمال خطوة الغسيل. بعد إزالة الغسيل الأخير ، أعد تحميل الآبار ب 50 ميكرولتر من كاشف مكبر الصوت المسبق ، ثم أغلق اللوحة باستخدام مادة مانعة للتسرب من الألومنيوم وقم بهز اللوحة عند 800 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

ثم استمر في رج الطبق على حرارة 50 درجة مئوية لمدة ساعة. عند اكتمال ذلك ، قم بإجراء خطوة غسيل أخرى. بعد ذلك ، أعد تحميل الآبار ب 50 ميكرولترا من كاشف مكبر الصوت ، وأغلق اللوحة بختم لوح ألومنيوم ، وكرر حضانة الاهتزاز لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة تليها ساعة عند 50 درجة مئوية ، تليها خطوة غسيل أخرى.

الآن قم بتدوير مسبار الملصق لمدة 10 ثوان بأقصى سرعة ثم أضف 50 ميكرولترا من مسبار الملصقات إلى كل بئر. ثم أعد إغلاق اللوحة وكرر حضانة الاهتزاز كما كان من قبل ، متبوعا بخطوة غسيل أخرى. بعد ذلك ، قم بتحميل الآبار ب 50 ميكرولترا من الستربتافيدين الطازج المخلوط ، ثم قم بإجراء حضانة الاهتزاز في درجة حرارة الغرفة عند 600 دورة في الدقيقة ، متبوعة بخطوة غسيل باستخدام المخزن المؤقت للغسيل Streptavidin.

بعد الانتهاء من خطوة الغسيل ، قم بتحميل كل بئر ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل Streptavidin وأغلق اللوحة بختم لوح الألمنيوم ، ثم رج اللوحة عند 800 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق. خلال خطوة الحضانة الأخيرة ، قم بتشغيل محلل الخرزة المغناطيسية وتأكد من معايرة الجهاز وتنفيذ بروتوكولات التحقق من الصحة. في البرنامج، أضف تحليلا جديدا عن طريق تحديد إنشاء دفعة باستخدام بروتوكول موجود من علامة التبويب الدفعات.

بعد ذلك ، في تخطيط اللوحة ، قم بتعيين الآبار على أنها غير معروفة أو فارغة وقم بتوفير ملصق لكل منها في لوحة العينة. الآن قم بإزالة ختم الألومنيوم من لوحة التفاعل ، وأخرج صينية محمل اللوحة ، وقم بتحميل اللوحة في المحلل. بعد ذلك ، انقر فوق سحب ، ثم قم بتشغيل Batch لبدء المحلل.

بعد القراءة ، أخرج اللوحة ونظف محلل الخرزة المغناطيسية على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة. للتحليل، انتقل إلى علامة التبويب نتائج الدفعات. حدد ملف التحليل المعني واستخدم الخيار لتصديره كملف csv ، ثم قم بإنشاء المتوسطات والدرجات الأولية باستخدام برنامج جدول بيانات.

تأكد من أن عناصر التحكم تظهر الإشارات المتوقعة. تطبيع عينة البيانات الأولية وتحليل توزيع البيانات باستخدام نظام أساسي لعلوم البيانات أو باستخدام خوارزميات محددة لتنفيذ تحليل مكون أساسي. يعد أداء قارئ الخرزة المتعددة والمقايسة أمرا بالغ الأهمية وتشغيل التخفيفات التسلسلية لعينات التحكم المشروحة جيدا قبل عينات المريض القيمة يضمن النتائج الصحيحة.

بالنسبة للسمات، حدد المجموعة الفرعية من بيانات الجينات الطبيعية ومتغير اسمي مثل النوع الفرعي لسرطان الثدي. تطبيق خوارزمية تصنيف مدربة ومعتمدة لتوصيف العينات غير المعروفة. تم تطبيق الطريقة الموصوفة للقياس المتزامن ل 40 نسخة في مادة FFPE ملطخة ب H & E ، وتشريح دقيق ، وشديدة التحلل.

باستخدام هذه الطريقة ، من الممكن إظهار التوصيف الدقيق لحالة المستقبل والتعبير التفاضلي لعلامة اللحمة المتوسطة FN1 عند مقارنة الورم والأنسجة الضابطة المتطابقة في الأنواع الفرعية المختلفة للمستقبلات الإيجابية والسالبة. يمكن تمييز عدم التجانس داخل الأورام باستخدام هذه الطريقة. يظهر الورم الإيجابي للطوارئ تعبيرا تفاضليا مكانيا ل FN1 داخل المناطق التي تظهر مورفولوجيا الورم المميزة والنشاط الانقسامي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس جينات متعددة مباشرة من محللات الأنسجة بعد تهجين الحمض النووي الريبي المستهدف إلى الخرز وتضخيم الإشارة والقياس الكمي. تسمح حساسية الفحص باستخدام مواد التشريح الدقيق بالليزر. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر معايرة الجهاز قبل كل اختبار وتحديد نطاق الحساسية باستخدام مواد مراقبة الجودة قبل إجراء عينات ثمينة من المرضى.

سير عمل الفحص قابل للتكيف بسهولة مع المختبرات السريرية. يمكن إجراء توصيف الحمض النووي الريبي لما يصل إلى 90 عينة في 12 ساعة على مدار يومين. يستغرق قياس حالة مستقبلات سرطان الثدي في مختبر علم الأمراض وقتا طويلا ويتطلب أخصائيي علم الأمراض ذوي الخبرة.

باستخدام هذا الاختبار الرقمي القائم على الخرزة المتعددة الإرسال يحدد تعبير الحمض النووي الريبي بدقة. تحليل المؤشرات الحيوية الجزئية في الخزعات في التشخيص الأولي هو عرض للورم. يؤدي استخدام هذه المنهجية مع لوحة علامات حيوية أوسع وأيضا استخدام أقسام كاملة إلى تحديد العينات غير المتجانسة.

يعد تطوير المقايسات باستخدام هذه المنهجية متعدد الاستخدامات ويتطلب مدخلات منخفضة للعينة. تتضمن العينة عينات سريرية مشروحة مهمة للتحقق من صحة المؤشرات الحيوية وكذلك الخزعات السائلة المهمة لمراقبة المريض والتشخيص المبكر.