القياس الكمي نسيجية لتحديد عبء الرئة الفطرية في أسبيرجيلوسيس التجريبية

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تحديد العبء الفطري الرئوي في الفئران المصابة بداء الرشاشيات الغازي عن طريق التحليل النسيجي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التسبب في الفطريات حول آليات استجابة المضيف الوقائية والضارة وعوامل الفراوعة الفطرية الرئيسية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدام العينات النسيجية الموجودة للحصول على عبء فطري مع نتائج قابلة للمقارنة مع التطبيق الكمي PCR للحمض النووي الفطري للرئة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لداء الرشاشيات الغازي ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على دراسات الأمراض الأخرى التي يمكن فيها تلطيخ مسببات الأمراض بشكل تفاضلي داخل الأنسجة المضيفة. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما بدأنا في التفكير في طرق بديلة لقياس العبء الفطري للرئة بتباين أقل من الطرق الكمية للحمض النووي. سيوضح إجراءات العدوى والحصاد أنجار تسوجيرال ، فني أبحاث.

قبل 24 ساعة من الإصابة ، استنفد العدلات في كل فأر تجريبي يبلغ من العمر سبعة إلى 10 أسابيع مع 0.5 ملليغرام من الجسم المضاد للفأر Ly-6G في محلول ملحي معقم يتم تسليمه داخل الصفاق بزاوية 45 درجة في الربع الأيمن السفلي الجانبي لكل وإعادة الفئران إلى أقفاصها. في صباح اليوم التالي ، اسكب 1.5 جرام من الخرز الزجاجي 0.5 ملم على صفيحة ثقافة A.fumigatus conidia وقم بإمالة اللوحة برفق ذهابا وإيابا حتى يتم تغليف الخرزات بالفطريات. اجمع خليط الخرز المطلي بالكونيديا في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر الخرزات في خمسة ملليلتر من DPBS.

دوامة الخرز لفصلها عن الفطريات وحساب الكونيديا في تخفيف 50X من المادة الطافية على مقياس كثافة الدم. قم بتخفيف الكونيديا إلى 1 في 10 إلى 8 كونيديا لكل مليلتر من تركيز DPBS وقم بتحميل 50 ميكرولترا من محلول الكونيديا لكل فأر في ماصات دقيقة فردية. بعد التأكد من عدم الاستجابة لقرص إصبع القدم ، ضع أول فأر مخدر على لوح مائل في وضع ضعيف وقم بتقييد القواطع العلوية برفق بشريط مطاطي والقواطع السفلية بسلك معدني.

بعد ذلك ، استخدم ملقطا صغيرا لتثبيت اللسان بعناية عند التمدد الكامل وتوصيل 50 ميكرولتر من محلول الكونيديا إلى قاعدة اللسان. حافظ على اللسان في حالة تمديد كامل ، واستمع إلى التنفس السريع وضوضاء النقر المميزة للشفط لمدة 20 ثانية أو حتى يتم شفط التعليق بالكامل. ثم أعد الفأر برفق إلى قفصه مع المراقبة حتى الاستلقاء الكامل ويصيب التالي.

عندما تصاب جميع الفئران بالعدوى ، قم بحقن مجموعة فرعية من بعامل مضاد للفطريات وكرر استنفاد العدلات في جميع بعد 24 ساعة من الإصابة. بعد ثلاثة أيام من إعطاء الفطريات ، ضع الفأر الأول في وضع ضعيف على لوح رغوي مغطى بلوحة ماصة. تأكد من القتل الرحيم للماوس بقرص إصبع القدم ، وتطهير الشعر بنسبة 70٪ من الإيثانول.

بعد تأمين الأطراف ، استخدم المقص لفتح تجويف الصدر العلوي بعناية لقطع القفص الصدري لكشف الرئتين والقلب. قم بقطع الوريد الأجوف السفلي المنحدر من القلب مع الحرص على تجنب قطع الأوعية الدموية الأخرى أو ثقب أي أعضاء ، واستخدم حقنة سعة خمسة ملليلتر مزودة بإبرة قياس 25 مثبتة بزاوية 45 درجة لبث خمسة ملليلتر من DPBS البارد ببطء في البطين الأيمن للقلب. بعد التروية بخمسة ملليلتر من 10٪ فورمالين بنفس الطريقة ، قم بتعريض القصبة الهوائية بعناية وافصل ضمادات الدهون المحيطة مع الحرص على عدم ثقب القصبة الهوائية.

ارفع القصبة الهوائية المكشوفة بالملقط واستخدم إبرة قياس 25 لعمل ثقب في القصبة الهوائية العلوية. أدخل قنية بحذر من خلال الفتحة باتجاه الرئتين واربط خيطا جراحيا بشكل غير محكم حول القصبة الهوائية لتأمين القنية. استخدم حقنة سعة مليلتر واحد لتضخيم الرئتين بمليلتر واحد من 10٪ من الفورمالين العازل عبر القنية وقم بإزالة القنية بسرعة ولكن بعناية.

شد الخيط الجراحي لإغلاق القصبة الهوائية واسحب الخيط برفق لفصل النسيج الضام مما يسمح بحصاد الرئتين والقصبة الهوائية. ضع الأنسجة في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر يحتوي على 15 مل من عازلة الفورمالين بنسبة 10٪ مع أحد طرفي الخيط خارج الأنبوب. بعد ذلك ، أغلق الغطاء واقلب الأنبوب لغمر العينة بالكامل والمثبت لمدة 24 ساعة على الأقل.

لتصوير الأنسجة المحصودة ، افتح أولا برنامجا مناسبا للقياس الكمي للتصوير واستخدم مجهرا ضوئيا للحصول على أربعة حقول مميزة على الأقل لكل شريحة من فضة الميثانامين المعدلة من Gomori ، أو شريحة ملطخة ب GMS ، تحت هدف 10X. تأكد من أن الصور تمثل الشعب الهوائية المصابة داخل الرئة وأنها تظهر كثافة أنسجة مماثلة. لإضافة أشرطة مقياس إلى الصور، ضمن القائمة تحرير، حدد إضافة/تحرير علامات المعايرة وحدد سمك الخط واللون وحجم شريط المقياس.

انقر فوق الصورة حيث سيتم وضع شريط المقياس ، ثم افتح قائمة تحرير وحدد دمج ودمج علامات المعايرة لإضافة شريط مقياس لكل صورة وحفظ الصور في مجلدات المجموعة التجريبية المناسبة. لحساب العبء الفطري في كل ، افتح برنامجا مناسبا لمعالجة الصور وافتح المجلد الأول من الصور. ضمن قائمة Image، حدد Type وRGB Stack لتحويل الصور.

باستخدام مفتاح السهم الأيمن، حدد الصورة الثانية من الصور الثلاث واضغط على Control-Shift-T لفتح أداة ضبط إعدادات قائمة Threshold. حدد موقع صورة tiff أو jpg الأصلية كمرجع وافتح الصورة باستخدام برنامج عرض الصور. عند تحديد قيمة العتبة ، من الأهمية بمكان أن تكون قادرا على عرض الصورة الأصلية بحيث تكون المنطقة المحددة ممثلة للخيوط الفطرية ولضمان الاتساق بين العينات.

حرك شريط التمرير العلوي بالكامل إلى اليسار واضبط شريط التمرير السفلي حتى تكون المنطقة الحمراء المحددة ممثلة لصورة الفحص المجهري. انقر فوق تعيين وموافق، وحدد تحليل القياسات وتعيينها للتحقق من المنطقة، وكسر المنطقة، والحد إلى الحد، وعرض التسمية وترك الإعدادات السفلية كإعدادات افتراضية. انقر فوق موافق وحدد تحليل وقياس.

يجب أن تظهر النتائج. بعد ذلك ، قم بتصدير البيانات إلى برنامج تحليل البيانات للرسم البياني والتحليل الإحصائي وأدخل متوسط النسب المئوية الأربع أو أكثر للمساحة لكل عينة رئة. كما يوضح هذا الرسم البياني التمثيلي للبقاء على قيد الحياة ، فإن الفئران التي تعاني من نقص الحمضات المصابة بداء الرشاشيات الغازي المعالجة بعامل مضاد للفطريات بعد العدوى تظهر زيادة في البقاء على قيد الحياة مقارنة بالحيوانات البرية.

يكشف تلطيخ GMS التمثيلي من الفئران البرية العدلية ونقص الحمضات المصابة بداء الرشاشيات الغازي عن تصفية فطرية شبه كاملة في الفئران بالضربة القاضية المعالجة بمضادات الفطريات والتي لا يتم تبادلها في البرية مع أو بدون علاج مضاد للفطريات. علاوة على ذلك ، يؤكد كل من PCR الكمي والفحص المجهري الخفيف اليدوي GMS كما هو موضح للتو أن العلاج بالعوامل المضادة للفطريات يؤدي إلى انخفاض العبء الفطري الأكثر أهمية بين الفئران البرية والفئران التي تعاني من نقص الحمضات. ومع ذلك ، في الفئران غير المعالجة ، حدد القياس الكمي GMS فقط انخفاضا كبيرا في الفئران التي تعاني من نقص الحمضات في هذه التجربة.

عندما يتم حساب متوسط مساحات المقاطع الملطخة بنظام GMS للرئة بالكامل تحت تكبير أربعة X ، فإن الاختلافات مماثلة للنتائج التي تم الحصول عليها من أربعة حقول تمثيلية 10X على الرغم من أنها ذات أهمية إحصائية أقل. لوحظت أيضا نتائج مماثلة للبقاء على قيد الحياة والعبء الفطري وإزالة الفطريات في الفئران التي تعاني من نقص الخلايا التائية في جاما دلتا المعالجة بنفس العامل المضاد للفطريات. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تظل متسقا عند التقاط صور للأقسام النسيجية وعند ضبط قيمة العتبة للحصول على نتائج قابلة للمقارنة.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى تتضمن التحليل النسيجي لعينات ذات اختلافات واضحة بين تلطيخ الهدف والخلفية للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بأمراض المرض في الرئتين والأنسجة الأخرى. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إصابة الفئران بالكونيديا الفطرية عن طريق الشفط اللاإرادي وكيفية قياس نمو الفطريات في أقسام أنسجة الرئة باستخدام برنامج معالجة الصور. لا تنس أن العمل مع Aspergillus fumigatus وصبغة الميثانامين الفضية المعدلة من Gomori يمكن أن يكون خطيرا وأن الاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية والعمل تحت غطاء جيد التهوية يجب دائما اتخاذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.