المسائل الحجم: قياس "القطر كبسولة" في المرسلة بين

الهدف العام من هذا الإجراء هو تلطيخ كبسولة عديد السكاريد من سلالات C.neoformans لتصور وقياس قطر الكبسولة. يمكن أن تساعد هذه الطرق الباحثين في تحريض وتصوير وقياس حجم الكبسولة في Cryptococcus neoformans. الميزة الرئيسية لتقنيات التلوين والتصوير هي أنها بسيطة وسريعة وتسمح بقياس دقيق لقطر الكبسولة.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث قد تكون خطوات البرنامج مربكة في المرة الأولى التي يتم فيها استخدامها. غالبا ما يستخدم قطر كبسولة Cryptococcus neoformans كمقياس للضراوة. يمكن أن توفر القدرة على أتمتة هذه العملية وقتا طويلا في التحليل.

للحث على إنتاج الكبسولة ، قم أولا باحتضان مستعمرة C.neoformans في مرق سكر العنب ببتون الخميرة عند 37 درجة مئوية مع الرج لمدة 18-36 ساعة حتى تصبح الثقافة في مرحلة السجل. في نهاية المزرعة ، قم بتقطيع الخميرة عن طريق الطرد المركزي وغسل الخميرة ثلاث مرات في PBS. بعد الغسيل الأخير ، أعد تعليق الخميرة مرتين 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر من تركيز DMEM واحتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 18 ساعة.

في اليوم التالي ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وقم بإزالة جميع الميكرولترات باستثناء آخر 10 ميكرولترات من المادة الطافية. لتلطيخ الخميرة بالحبر الهندي ، قم بتعليق الحبيبات في المادة الطافية المتبقية وانقل أربعة ميكرولترات من تعليق الخلية وأربعة ميكرولترات من الحبر الهندي على شريحة مجهر زجاجي. امزج المحلول الناتج برفق دون تكوين فقاعات.

ثم ضع غطاء زجاجي بسمك 1.5 13 ملم فوق عينة الخلية وأغلق الحواف بمادة مانعة للتسرب غير سامة. لتلطيخ الخميرة بصبغة فلورية ، قم بتعليق حبيبات الثقافة الليلية في 50 ميكرولتر من PBS مكملة بمصل بقري بنسبة 1٪ واحتضان الخلايا في 55-60 ميكرولتر من الجسم المضاد أحادي النسيلة أحادي النسيلة 18B7 كبسولة الكالكوفلور الأبيض و Alexa Fluor 488 لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في 10 ميكرولتر من PBS بالإضافة إلى زلال مصل الأبقار.

ثم انقل ثمانية ميكرولترات من الخلايا إلى شريحة مجهر زجاجي ، وقم بتغطية عينة الخلية بغطاء زجاجي بسمك 1.5 13 ملم وختم الحواف بمادة مانعة للتسرب غير سامة. لتلطيخ الخميرة بكلتا الصبغتين ، قم أولا باحتضان الخلايا بكبسولة فلورية وصبغة جدار الخلية كما هو موضح للتو. ثم أضف أربعة ميكرولترات من الخلايا الملطخة بالفلورسنت وأربعة ميكرولترات من الحبر الهندي على شريحة زجاجية وضع غطاء مغلق فوق عينة الخلية الفطرية كما هو موضح.

لتصوير الخلايا بواسطة الفحص المجهري الضوئي، حدد الهدف 100X وقم بتصوير 50 خلية غير متداخلة على الأقل لكل حالة مع أوقات تعريض ضوئي محسنة لزيادة تباين الصورة إلى أقصى حد مع تقليل الضبابية الناتجة عن حركات الخلايا الصغيرة. لتصوير الخلايا عن طريق الفحص المجهري الفلوري ، افتح برنامج التصوير المجهري وحدد الأطوال الموجية المناسبة للإثارة والانبعاث للفلوروفورات المستخدمة. في لوحة تحكم مكدس Z، حدد الخيار الأخير الأول.

باستخدام التحكم الدقيق في التركيز على المجهر ، ركز أولا أسفل أوسع نقطة في جسم الخلية لخلية خميرة واحدة والكبسولات لجميع الخلايا داخل مجال الرؤية الحالي وانقر فوق التعيين أولا. بعد ذلك، استخدم عنصر التحكم الدقيق في التركيز البؤري فوق أوسع نقطة في جسم الخلية لنفس الخلية والكبسولة لجميع الخلايا داخل مجال الرؤية الحالي وانقر فوق تعيين الأخير. ثم افتح علامة تبويب الاستحواذ وانقر فوق بدء التجربة للحصول على مكدس Z للمركز الحالي.

لقياس أقطار الكبسولة والخلية يدويا ، افتح برنامجا مناسبا لقياس الخلية وحدد الصورة المراد قياسها. حدد القياس واستخدم المؤشر لرسم خط مستقيم عبر أوسع نقطة في الخلية بأكملها لقياس إجمالي قطر الخلية. انقر فوق القياس مرة أخرى وارسم خطا مستقيما عبر جسم الخلية لقياس قطر جسم الخلية وافتح الخلية التالية.

عندما يتم قياس جميع الخلايا ، احفظ الصور. للقياس الآلي لأقطار الكبسولة والخلية ، افتح أولا برنامجا مناسبا لتحرير الصور واقلب جميع صور الخلايا الملطخة بالحبر الهندي. بعد ذلك ، لاستيراد كل من الصور الأصلية والمقلوبة إلى برنامج قياس الخلية ، افتح قائمة الملفات في برنامج القياس وحدد تسلسل الاستيراد ، وتحميل الصورة ، وتحديد التسلسل يدويا ، وقناة الأبعاد ، والاستيراد ، والتطبيق.

لاكتشاف جسم الخلية وإخفائه ، حدد بروتوكول مضان محلل المستعمرة لأول صورة مقلوبة محل اهتمام وانقر فوق تطبيق. حدد بروتوكول مضان محلل المستعمرة مرة أخرى لتقسيم صور جسم الخلية C.neoformans المقلوبة من كبسولاتها وانقر فوق تطبيق مرة أخرى لإنشاء قناع عد. انقر بزر الماوس الأيمن لإعادة تسمية جسم خلية قناع العد واستخدم بروتوكول تكاثر الخلايا على الصورة الأصلية لاكتشاف الكبسولة وإخفائها.

انقر فوق تطبيق لإنشاء قناع عد للصورة الأصلية وإعادة تسمية كبسولة قناع العد. لإنشاء قناع جديد على الصورة الأصلية لتقسيم الكبسولات المجاورة عن بعضها البعض، حدد قسم الكبسولة والكبسولة لمنطقة الكبسولة. لتصدير البيانات ، انقر فوق جدول البيانات ثم انقر فوق رمز التصدير إلى جدول البيانات.

حدد القياسات التي ترغب في تصديرها ثم احفظ البيانات في النهاية. زيادة حجم الكبسولة واضحة في معظم السلالات بعد التحريض ، على الرغم من أن بعض السلالات تظهر كبسولات صغيرة بشكل طبيعي. في هذه التجربة التمثيلية ، لوحظ اختلاف كبير في حجم الكبسولة باستمرار بين السلالة الأكبر والسلالتين الأصغر.

يمكن أيضا اكتشاف الاختلافات في حجم الكبسولة باستخدام الأصباغ الفلورية. يضمن التقاط صورة مكدس Z الحصول على الحد الأقصى لقطر الكبسولة وجسم الخلية لكل خلية. يمكن بعد ذلك معالجة المداخن لإنتاج إسقاطات قصوى كثافة للقياس اليدوي لكبسولة خلية الخميرة وقطر الخلية.

لا يوجد فرق كبير داخل التجربة بين قياسات الكبسولة باستخدام أي من طريقتي التلوين ، على الرغم من ملاحظة تباين أكبر بين التجارب عند استخدام الحبر الهندي لقياس أقطار الكبسولة مقارنة بصبغة الفلورسنت. لا يتم ملاحظة الاختلافات الكبيرة في قياسات قطر الكبسولة بين الباحثين المختلفين عادة بغض النظر عن الطريقة المستخدمة بينما يمكن اكتشاف اختلافات صغيرة ولكنها كبيرة في حجم الكبسولة باستخدام طريقة القياس الآلي. من أجل القياس الآلي الناجح ، يجب أن تكون الخلايا في بؤرة التركيز ، وأن تحتوي على كبسولة متوسطة إلى كبيرة ، وألا تكون متجمعة بشكل مفرط.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحفيز الكبسولة في Cryptococcus neoformans ، وتلطيخها باستخدام حبر الهند أو تلطيخ الفلورسنت ، وتصوير الكبسولة ، وقياسها عبر البرامج الآلية.