أسلوب لتحديد آثار الإثراء البيئي في القولون ميكروبيومي التنوع البيولوجي في نموذج ورم القولون الماوس

الهدف الرئيسي من هذا المنشور هو تقديم طريقة لتطبيع ميكروبيوم القوارض. في هذا العرض التوضيحي ، يتم فحص تأثير التخصيب البيئي على الميكروبيوم أثناء تكوين ورم القولون. يوضح هذا البروتوكول كيف يؤدي تطبيع الميكروبيوم قبل تدخل التخصيب البيئي إلى تحسين قابلية التكاثر التجريبي.

نوضح أيضا كيفية تقليل الإجهاد الحيواني وتحسين التفاعلات باستخدام بيئة غنية. على الرغم من أننا ركزنا على تأثير الإثراء البيئي في نموذج ورم القولون ، إلا أنه يمكن تطبيق الطريقة بسهولة لفهم دور الميكروبيوم في مسببات المرض بشكل أفضل. قم بإعداد الأقفاص في ظروف معقمة تعمل تحت غطاء جيد التهوية.

تتكون عناصر التحكم في هذه التجربة من أقفاص تقليدية مع فراش وأنسجة مختبرية للتعشيش ، ولكنها تفتقر إلى أجهزة التخصيب. لإنشاء أقفاص تربية الجرو أو الأقفاص المخصبة بيئيا ، قم بتوصيل قفصين كبيرين معقمين بنفق معقم مؤمن بالحلقة وقم بتضمين منصة معقمة في كل قفص لزيادة مساحة الأرضية. بالنسبة إلى EE ، قم أيضا بتوفير عجلات تشغيل معقمة ، وأنفاق ، وأكواخ ، وأكواخ ، وكرات زحف ، ومواد تعشيش.

ضع كل من الأقفاص المخصبة وأقفاص التحكم في نفس الرف لتوفير تهوية متساوية. للتكاثر ، اجمع بين أب واحد وسدين محتملين في أقفاص عادية. كل صباح ، تحقق من السدادات المهبلية التي تشير إلى أن قد تزاوج أثناء الليل.

إذا لم يتم رؤية سدادة ، يمكن لمقاومة الفحص المهبلي اكتشاف سدادة داخلية. إذا كان لدى الأنثى سدادة مهبلية ، فقم بنقلها إلى قفص كبير لتربية الجرو. يمكن إيواء ما يصل إلى 12 سدا للحامل في أقفاص غنية بيئيا بمنصات بشرط أن يتم الولادة جميعا خلال نفس الأسبوع.

عندما يبلغ عمر الجراء من 21 إلى 28 يوما ، قم بتوزيع الذكور والإناث حسب النمط الجيني في بيئات التحكم أو البيئات المخصبة. تأكد من الاحتفاظ بنسبة من كل نمط جيني في كل قفص. يمكن أن تدعم الأقفاص غير المخصبة ما يصل إلى خمسة فئران بينما تتطلب الأقفاص المخصبة ما لا يقل عن 20 فأرا للتحفيز الاجتماعي ويمكن أن تدعم ما يصل إلى 41 فأرا.

ابدأ في جمع البراز قبل يوم أو يومين من القتل الرحيم للفئران. اجمع دائما في نفس الوقت من اليوم. لجمع البراز من الحية ، قم بتقطيع بعناية فوق قفص نظيف.

ثم اجمع البراز المتغوط باستخدام ملقط معقم وانقله إلى أنبوب ميكرو فوج معقم. إذا لم يتغوط على الفور ، ضعه في قفص نظيف وانتظر حتى يتغوط والذي قد يستغرق ما يصل إلى ساعة. لجمع البراز من قتل رحيم ، قم بتشريحه للوصول إلى القولون.

ثم اقطع القولون أسفل الأعور مباشرة وضع القولون على قطعة من ورق الترشيح. ثم استخدم الملقط لرفع الجزء العلوي من أنبوب القولون وفتح التجويف باستخدام المقص. قطع طوليا بعيدا إلى قريب لفتح القولون بالطول.

ثم اجمع البراز من القولون البعيد إلى أنبوب ميكروفوج معقم باستخدام ملقط معقم. قم بتخزين عينات البراز عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. بالإضافة إلى البراز ، اجمع عينات الأنسجة الأخرى من القولون والأمعاء الدقيقة ، والميكروسومات ، والأنسجة الدهنية ، وما إلى ذلك.

استخدم مجموعة تجارية لعزل الحمض النووي الميكروبي من البراز باتباع بروتوكول الكشف عن مسببات الأمراض في البراز. عند القيام بذلك ، انقل العينات من الفريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر على الثلج الجاف ووزنها. بعد ذلك ، قم بإعداد تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يضخم الحمض النووي الميكروبي كما هو موضح في بروتوكول النص.

ثم قم بتنظيف منتجات التفاعل باستخدام الخرز المغناطيسي. للتنظيف ، قم أولا بالطرد المركزي لفترة وجيزة للوحة Amplicon PCR لتجميع منتجات التفاعل. بعد ذلك ، قم بدوامة الخرزات المغناطيسية لتفريقها بالتساوي ونقل 20 ميكرولتر إلى كل تفاعل جيدا.

امزج الخرزات مع المحلول جيدا عن طريق سحب الحجم بالكامل ببطء 10 مرات. ثم دع الخرز يستقر لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، ضع لوحة PCR على حامل مغناطيسي وانتظر دقيقتين حتى يتم مسح المواد الطافية بعد الجمع المغناطيسي للخرز.

ثم قم بإزالة المواد الطفية والتخلص منها. بعد ذلك ، مع بقاء اللوحة على المغناطيس ، املأ كل بئر من الخرز ب 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪ وانتظر 30 ثانية. ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية.

كرر خطوة الغسيل هذه مرة واحدة واترك الخرزات تجف في الهواء لمدة 10 دقائق. الآن قم بإزالة نواتج التفاعل من الخرزات عن طريق إزالة اللوحة من الحامل المغناطيسي وإضافة 52.5 ميكرولتر من Tris إلى كل بئر. امزج الخرزات تماما في المحلول عن طريق سحب الحجم بالكامل ببطء 10 مرات.

ثم اجمع الخرزات على الحامل المغناطيسي كما كان من قبل وانقل 50 ميكرولترا من المادة الطافية إلى لوحة PCR نظيفة. غطي الطبق بمادة لاصقة شفافة واحفظيه على حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة تصل إلى أسبوع واحد. استخدم المادة الطافية التي تم جمعها لإجراء فهرس PCR لإرفاق الرموز الشريطية بتسلسل المحول.

ثم قم بتنقية المنتجات وإعداد المكتبة المفهرسة للتسلسل. في الفئران ، من المعروف أن الإثراء البيئي يحسن العمر الافتراضي وإصلاح جروح الورم. لتحديد دور الجراثيم في هذا النمط الظاهري ، تم دمج التكاثر في مستعمرة الفئران لمدة شهر واحد على الأقل لتطبيع الجراثيم.

ثم تم تربيتها وترعرعت ذريتهم في بيئة غنية أو بيئة طبيعية. كانت النسل أيضا حاملة للورم أو من النوع البري. بعد 16 أسبوعا ، تم قتل وجمع عينات البراز لعزل الحمض النووي الميكروبي.

بعد ذلك ، تم استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم الوحدة الفرعية الريبوزومية 16S في العينات لمسح مكونات الميكروبيوم. ثم تم تحديد نواتج التفاعل باستخدام فهرسة الرمز الشريطي. ومن المثير للاهتمام أن البيئات المحسنة لا تحسن التنوع البيولوجي في البرية ، ولكنها تزيد بشكل كبير من التنوع البيولوجي في الحاملة للورم.

هذا يدل على حساسية الطريقة. تعزى هذه الزيادة في التنوع البيولوجي إلى زيادة وجود شعبة البكتيريا البروتينية مع زيادات كبيرة في فئات البكتيريا alphaproteobacteria و betaproteobacteria وانخفاض في البكتيريا gammaproteobacteria المسببة للأمراض. كانت أكبر زيادة في فئة البكتيريا البيتابروتيوبية في جنس Sutterella ، وهو من المحتمل أن يكون متعايشا يشارك في تحلل الغلوبولين المناعي المفرز.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تغيير ممارسات التربية لتطبيع الميكروبيوم بين التجارب قبل البدء في تدخلاتك التي تهمك. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، تذكر أن قد أنشأت أراضيها داخل البيئة. لهذا السبب ، يمكن أن تسبب التغييرات في البيئة ضغوطا تؤثر على ميكروبيوم.

التغيير المفاجئ في سلوك هو علامة جسدية على الإجهاد. بعد هذا الإجراء ، يمكن عزل ميكروبات معينة وتوصيفها بشكل أكبر لاختبار كفاية الميكروب المحدد في تطور المرض.