اثنين-فوتون تصوير إينترافيتال من الكريات البيضاء خلال الاستجابة المناعية في الكبد تعامل Lipopolysaccharide الماوس

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة مورفولوجيا ووظائف الكريات البيض داخل الكبد أثناء الصدمة الإنتانية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكنك الحصول على مقاطع فيديو مباشرة للكريات البيض داخل الكبد. قبل الجراحة ، استخدم 70٪ من الإيثانول لتطهير طاولة الجراحة وجميع الأدوات.

ثم قم بإعداد أدوات جراحة الكبد واضبط لوحة التسخين على 37 درجة مئوية. بعد تخدير الفئران المحقونة LPS أو PBS وفقا لبروتوكول النص ، ضع كمية صغيرة من مرهم العين لمنع شبكية العين من الجفاف. استخدمي ماكينة حلاقة وكريم لإزالة الشعر لإزالة الشعر حول البطن.

ثم استخدم الشاش المبلل لتنظيف البطن. أثناء إجراء حقن مداري رجعي باستخدام حقنة الأنسولين ، قم بحقن 200 ميكرولتر من محلول ديكستران الأحمر من تكساس. استخدم علامة لتحديد المنطقة تحت الضلعية اليمنى من عملية الخفافير إلى نهاية الضلع.

ثم ضع بوفيدون اليود على بطن الفأر لمنع العدوى الثانوية. استخدم الملقط والمقص لقطع البشرة. بعد ذلك ، باستخدام المقص الصغير والملقط ، افتح تجويف البطن وفضح الكبد بعناية.

استخدم مسحات القطن لفرد الفص الجانبي الأيسر. ثم صب 500 ميكرولتر من PBS المعقم على تجويف البطن لمنع الكبد من الجفاف. ضع الماوس في وضع التهاب الاستلقاء الصحيح في غرفة مصممة خصيصا وقم بتطبيق كمية صغيرة من غراء المناديل على سرير السيليكون.

ثم استخدم مسحات القطن لربط الكبد بعناية. أنسجة الكبد قابلة للتفتيت للغاية. لا تستخدم أبدا أدوات حادة أو ثقيلة عند تعريض الكبد وإمساكه.

بعد بضع ثوان ، بلل الكبد مرة أخرى ب 500 ميكرولتر من PBS المعقم لمنعه من الجفاف. ثم ضع الإطار المعدني على الكبد واستخدم المكسرات لإصلاحه بإحكام. ضع دائما الصواميل الداعمة قبل وضع الإطار المعدني.

سيساعد ذلك في تقليل ضغط الإطار المعدني. لإجراء تصوير داخل حيوية للكبد ، قم بتشغيل برنامج Zen لتشغيل الليزر. اضبط الطول الموجي على 880 نانومتر واضبط القناتين الخضراء والحمراء.

ثم اضبط قوة الليزر وفقا لشدة التألق. ضع الغرفة على مرحلة التصوير وضع العدسة الموضوعية الغمر في الماء بقوة 20 بالقرب من زجاج الغطاء. قم بتثبيت سخان مطاط السيليكون أسفل جسم الماوس للحفاظ على درجة حرارة جسمه.

بعد ذلك ، ارسم 500 ميكرولتر من الماء المقطر على الإطار المعدني. ثم ضع العدسة الموضوعية بالقرب من الكبد. اضبط التركيز وحدد عمق ووقت منطقة التصوير.

للتصوير طويل الأمد ، قم بحقن نصف جرعة من خليط التخدير المحضر السابق Zoletil و Rompun لكل ساعة أثناء التصوير لأسباب أخلاقية. حافظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية وراقب الفأر دائما لأن أوقات التخدير تختلف من فأر إلى آخر. لتحليل البيانات ، افتح Velocity واستورد البيانات الأولية من المكتبة.

ثم قم بإزالة الضوضاء من الصورة والتقط لقطة. أخيرا ، قم بتركيب العناصر التي تم تحريرها بنسبة 100٪ وقم بتصدير الملفات كملفات JPEG أو TIF للصور اللقطة وملفات AVI للأفلام. أظهر تحليل التصوير داخل الحيوية للفئران الضابطة أن عددا صغيرا من العدلات كان ينتشر في الأوعية الدموية.

في حين أن عدد العدلات قد زاد بشكل كبير في الفئران المعالجة ب LPS. في حالة LPS ، كان الكثير من العدلات ينتشر داخل مجرى الدم لكنها لم تهاجر خارج الوعاء. كما رأينا في هذه الأفلام ، مقارنة بالفئران الضابطة ، كانت العدلات في الفئران المعالجة LPS ملتصقة بقوة أكبر بالسطح اللمعي للوعاء مما جعل العدلات يتم اكتشافها بشكل متكرر في الوعاء.

بصرف النظر عن حركة العدلات ، لوحظت الضامة المحفظية الكبدية ، أو LCMs ، في فئران CX3CR1-GFP على سطح أنسجة الكبد بدلا من أعماق الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت LCMs القليل من الحركة أو التنشيط في الكبد حتى في الفئران المعالجة ب LPS. بمجرد إتقان هذه التقنية يمكن القيام بها في 30 دقيقة إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر ضبط خط الشق من عملية الخنجري إلى نهاية البطن تحت الضلعي الأيمن. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل حقن العلاج من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل كيفية تعافي الكبد من التلف والعدوى. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الطب لاستكشاف تفاعل الكريات البيض أثناء الإنتان واختبار الأدوية المحتملة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تعريض الكبد بأقل شق في البطن. لا تنس أن العمل مع عديدات السكاريد الدهنية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل التعقيم وغسل اليدين أثناء تنفيذ هذا الإجراء.