استخدام الإنسان التي يسببها Pluripotent الخلايا الجذعية المشتقة مثل تتمثل الخلايا لاكتشاف المخدرات

الهدف العام من هذه التجربة هو التفريق بين الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية إلى خلايا شبيهة بخلايا الكبد بطريقة مناسبة للفحص عالي الإنتاجية. يصعب نمو خلايا الكبد في المختبر ، ولكن يمكن أن تتولد من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات والتي توفر منصة فحص لتحديد علاجات أمراض الكبد. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن توليد أعداد غير محدودة من خلايا الكبد من أي مريض مصاب بأمراض الكبد التي تلخص المرض في المختبر.

السهل نسبيا تحديد الإجراء ، حتى بدون معرفة واسعة ببيولوجيا الخلايا الجذعية. تسمح قابلية التكاثر للباحثين بفحص آلاف المركبات دون الحاجة إلى الروبوتات المعقدة. سيقوم راي ليو ، زميل ما بعد الدكتوراه ، وبيج لامبريشت ، طالبة الدراسات العليا ، بعرض الإجراء اليوم.

أولا ، قم بتخفيف بروتين الانصهار Ecad إلى 15 ميكروغرام لكل مليلتر باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco ، أو DPBS ، الذي يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم. قم بتغطية أطباق زراعة الأنسجة المعلقة مقاس 100 ملم بخمسة ملليلتر من المصفوفة المخففة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. بعد الحضانة, إزالة الركيزة, واستبدال مع خمسة ملليلتر من وسط ثقافة iPSC.

استرجع قارورة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بالتبريد من النيتروجين السائل. قم بإذابة الثلج عند 37 درجة مئوية حتى تبقى بلورة جليدية صغيرة. بعد ذلك ، قم بتقطيع الخلايا برفق إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مليلتر يحتوي على أربعة ملليلتر من وسط الاستزراع.

الطرد المركزي للخلايا عند 300 جم لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا برفق بخمسة ملليلتر من الوسط مكملا بعشرة ميكرومولار من Y-27632 ، وهو مثبط انتقائي لبروتين كيناز مرتبط ب Rho ويحتوي على ملف ملفوف. الآن ، قم بإزالة وسط الثقافة من أطباق زراعة الأنسجة المعلقة المغلفة بعشرة ملليمترات من Ecad وأضف خمسة ملليلتر من الخلايا.

بمجرد أن تصل iPSCs إلى حوالي 80٪ التقاء, إزالة وسط الثقافة وغسل مرة واحدة مع DPBS خالية من الكالسيوم والمغنيسيوم. قم بشفط DPBS وأضف كمية كافية من محلول EDTA 0.02٪ لتغطية الأطباق. ثم احتضان الخلايا لمدة تصل إلى ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بمجرد أن تبدأ الخلايا في الإطلاق ، قم بإزالة محلول EDTA بنسبة 0.02٪ وغمر الطبق بعشرة ملليلتر من وسط M لتحرير الخلايا. ساعد في فصل iPSCs عن طريق سحب العينة اللطيف. انقل 1/10 من الخلايا العالقة لكل طبق ثقافة أنسجة طازج مطلي ب Ecad يحتوي على خمسة ملليلتر من متوسط M.

احتضان المزارع عند 37 درجة مئوية تحت 4٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، وتغيير الوسط يوميا. استرجع قارورة واحدة من 250 ميكرولتر من مخزون المصفوفة المثلجة بتركيز ملليغرامين لكل مليلتر وقم بإذابة الثلج. بعد ذلك ، امزج المصفوفة المذابة مع عشرة ملليلتر من DMEM / F12 البارد عن طريق الخلط برفق باستخدام ماصة مبردة مسبقا لتكوين تركيز نهائي يبلغ 0.05 ملليغرام لكل ملليلتر.

انقل 100 ميكرولتر من المصفوفة المخففة إلى كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 96 بئرا. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية تحت 4٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة على الأقل. بعد الحضانة ، تخلص من المصفوفة واستبدلها ب 50 ميكرولترا من متوسط M لكل بئر ، مع تكرار نفس إجراء الطلاء مع بقية الألواح.

الآن, ثقافة iPSCs على 100 أطباق مليمتر حتى تقترب الخلايا من 80٪ التقاء. لحصاد iPSCs من كل 100 لوحة ملليمتر, شفط وسط الثقافة وشطف مع خمسة ملليلتر من DPBS. استبدل الشطف بثلاثة ملليلتر من محلول انفصال الخلايا ، مثل Accutase.

ثم احتضن لمدة دقيقتين تقريبا عند 37 درجة مئوية تحت 4٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بمجرد أن تبدأ الخلايا في الانفصال ، احصد بإضافة سبعة ملليلتر من وسط M. الماصة عدة مرات لفصل مستعمرات الخلايا إلى مجموعات صغيرة من حوالي ثلاث إلى ست خلايا.

التالى, جمع iPSCs في 15 أنبوب الطرد المركزي المعقم ملليلتر وجهاز الطرد المركزي في 300 ز لمدة خمس دقائق. عند الانتهاء, قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في خمسة ملليلتر من وسط M. قم بتوزيع الخلايا بالتساوي على ألواح مغلفة بمصفوفة مكونة من 96 بئرا عن طريق سحب 50 ميكرولترا من خلايا التعليق في كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات.

بعد ذلك ، قم بزراعة الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية تحت 4٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون وكرر إجراءات بذر الخلايا مع باقي الألواح. افحص الألواح المكونة من 96 بئرا عن طريق الفحص المجهري للتأكد من أن الخلايا تغطي 70٪ على الأقل من سطح كل بئر على حدة. في اليوم الأول إلى اليوم الثاني من التمايز ، استبدل وسط الاستزراع ب 100 ميكرولتر من وسط التمايز القائم على RPMI لكل بئر.

بعد ذلك ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في الأكسجين المحيط و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين مع تغيير متوسط يومي. في اليوم الثالث إلى اليوم الخامس من التمايز ، استبدل وسط الاستزراع ب 100 ميكرولتر من وسط التمايز القائم على RPMI مكمل بنسبة 2٪ B27 و 100 نانوجرام لكل مليلتر من NA النشط. زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في الأكسجين المحيط و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أيام مع تغيير متوسط يومي. في اليوم الخامس للتمايز ، عالج كل بئر ب 100 ميكرولتر من محلول EDTA 0.02٪ لمدة 30 ثانية وقم بإزالة المحلول على الفور.

أضف 100 ميكرولتر من وسيط التمايز الطازج القائم على RPMI وكرر نفس الإجراء لبقية الألواح. للتمييز بين الأيام من السادس إلى العاشر ، استبدل وسط الاستزراع ب 100 ميكرولتر من وسط التمايز القائم على RPMI. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية تحت 4٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمسة أيام مع تغيير متوسط يومي.

للتمايز بين الأيام من 11 إلى 15 ، استبدل وسط الاستزراع ب 100 ميكرولتر من وسط التمايز القائم على RPMI ، مع استكمال 2٪ B27 و 20 نانوغرام لكل مليلتر من HGF. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية تحت 4٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمسة أيام مع تغيير متوسط يومي. للتمايز بين الأيام من 16 إلى 20 ، استبدل وسط الاستزراع بوسط زراعة خلايا الكبد مكمل ب 20 نانوغرام لكل مليلتر من oncostatin-M.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في الأكسجين المحيط و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمسة أيام مع تغيير متوسط يومي. عند الانتهاء من التمايز في اليوم 20 ، استبدل وسط الاستزراع ب 100 ميكرولتر من وسط زراعة خلايا الكبد الطازجة مع 20 نانوغرام لكل مليلتر من Oncostatin-M. بعد الحضانة لمدة 24 ساعة ، استرجع وسط الاستزراع في طبق طازج مكون من 96 بئرا وقم بتخزينه على حرارة 20 درجة مئوية.

كرر نفس إجراء التجميع لبقية اللوحات. أضف 90 ميكرولترا من وسط زراعة خلايا الكبد الطازجة المكملة ب oncostatin-M في كل بئر من اللوحة المكونة من 96 بئرا. أضف عشرة ميكرولترات من كل مركب مختار من محلول مخزون عمل معد مسبقا.

إضافة DMSO إلى 0.2٪ إلى آبار التحكم لتتناسب مع التركيز النهائي في العينات المعالجة. بعد الحضانة لمدة 24 ساعة ، اجمع وسط الاستزراع في طبق طازج مكون من 96 بئرا واحفظه على حرارة 20 درجة مئوية. كرر نفس إجراء التجميع لبقية اللوحات.

بعد خمسة أيام من العلاج ، تعبر الخلايا عن البروتينات التي يتم التعبير عنها بشكل مميز في الأديم الباطن النهائي. بعد خمسة أيام أخرى من التمايز ، يتحول الأديم الباطن إلى مصير كبدي ، وتعبر الخلايا عن FOXA2 و HNF 4a. بعد إضافة HGF ، تعبر الخلايا عن البروتينات الموجودة في خلايا الكبد الجنينية ، وعند الانتهاء من التمايز ، تتبنى الخلايا مورفولوجيا متوازية مع نواة تحتوي على نوى بارزة وسيتوبلازم كبير به قطرات دهنية متعددة.

تلغيم مناعي للكشف عن HNF 4a والألبومين في اليوم 20 من التمايز يظهر أن توزيع بروتينات خلايا الكبد هذه متشابهة عبر جميع الآبار. تم استخدام iPSCs للفحص عن المركبات الخافضة APOB لتقديم مثال على استخدام خلايا الكبد المشتقة من iPSC لفحص الجزيئات الصغيرة. العامل z لمقايسة APOB هو 0.73 ، مما يؤكد ملاءمة استخدام النظام الأساسي لاكتشاف الأدوية.

تم تحديد نسبة APOB بعد الدواء وقبل الدواء لكل مركب. تم تحديد الضربات عن طريق تحليل الدرجات z. تم تحديد 24 ضربة محتملة بنسبة APOB من 0.86 إلى 0.44.

بعد استبعاد المركبات التي كان لها تأثير سلبي على بقاء الخلية ، وجد أن مركبين قابلين للتكرار لخفض APOB. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون 25 يوما إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحضير وسيط طازج يوميا.

سيؤدي التركيز غير الصحيح للمكونات بسبب التحلل إلى تغيير قدرة الخلايا على التمايز. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال اكتشاف الأدوية لاستكشاف العلاج العلاجي لأمراض الكبد باستخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية زراعة الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان والحفاظ عليها وإجراء التمايز الكبدي في شكل ضغط سطحي صغير للفحص عالي الإنتاجية.

لا تنس أن العمل مع الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما ارتداء معدات الحماية الشخصية ، مثل القفازات ومعطف المختبر ، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.