جمع وتجهيز العقد الليمفاوية من الحيوانات الكبيرة لتحليل الحمض النووي الريبي: التحضير للدراسات ترانسكريبتوميك العقدة الليمفاوية للأنواع الحيوانية الكبيرة

مرحبا ، اسمي الدكتور روبرت شوت وأنا عالم في المركز الوطني لأمراض في أميس ، أيوا. في فيديو JoVE هذا ، سنشارك معك معلومات حول جمع ومعالجة الغدد الليمفاوية من الكبيرة لاستخدامها في تجارب الحمض النووي الريبي النهائي. على سبيل المثال ، قد تتضمن هذه التجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي على المنتجات المنسوخة العكسية ، أو دراسات تسلسل الحمض النووي الريبي للنسخ.

الغدد الليمفاوية عينات مفيدة لتقييم الاستجابات المناعية للمضيف ولكنها يمكن أن توفر أيضا مصدرا للحمض النووي الريبي الممرض للدراسة ، مثل حالة مسببات الأمراض داخل الخلايا الموجودة في الخلايا المناعية داخل الغدد الليمفاوية. تعتبر العينات من الكبيرة ، بما في ذلك أنواع الماشية والحياة البرية ، ذات أهمية في دراسة الأمراض الحيوانية المنشأ. هنا ، في المركز الوطني لأمراض ، ندرس عدوى الماشية بأنواع مثل البروسيلا أباهثث ، الذي يسبب داء البروسيلات في الماشية والبيسون ، والإشريكية القولونية O157: H7 التي يتم التخلص منها من المسارات المعوية للماشية.

سنقوم أيضا باستعادة عينات الأنسجة من أنواع الحياة البرية ، مثل الغزلان والأيائل. يمكن جمع مجموعة من الغدد الليمفاوية من المصابة بأمراض مختلفة. تعتبر دراسات الأنسجة في هذه الأنواع المضيفة الطبيعية بشكل عام أكثر صلة بالتطور الطبيعي للمرض من نماذج الفئران.

ومع ذلك ، فإن عملية حصاد الأنسجة من الأنواع الكبيرة هي بالضرورة أكثر تعقيدا من الفئران ، بما في ذلك التأخير الأطول بين القتل الرحيم وجمع الأنسجة ، وحجم أكبر من الغدد الليمفاوية. هنا ، سنقدم بروتوكولا لعزل الغدد الليمفاوية الحيوانية الكبيرة لدراسة الحمض النووي الريبي والذي سيكون مفيدا لعلماء الأحياء الجزيئية المشاركين في الدراسات النسخية للعدوى الحيوانية الكبيرة ، وكذلك الباحثين البيطريين الذين يبدأون دراسات النسخ. في هذا الفيديو ، سنعرض إجراءات على الغدد الليمفاوية للماشية.

قبل التشريح ، نوصي بتجميع المستلزمات التالية الخاصة بإجراء عزل الأنسجة. أنابيب الطرد الدقيق مملوءة بحوالي 1 مل من المواد الحافظة لأنسجة الحمض النووي الريبي ، مثل الحمض النووي الريبي ، والمشارط التي تستخدم لمرة واحدة ، والملقط النظيف والأوتتوكلاف ، وإبر الخزعة ، وحاوية الأدوات الحادة للمشارط والإبر المستخدمة ، وإما لوح تقطيع أو صينية يمكن التخلص منها ، اعتمادا على مستوى عدوى المواد المعنية. في هذه الحالة ، سنوضح العناصر الرئيسية للإجراء باستخدام الغدد الليمفاوية التي نجمعها بشكل عام من الماشية.

إنهم مصابون بالبكتيريا التي تسبب داء البروسيلات. هذه هي الغدد الليمفاوية قبل الكتف والعقدة الليمفاوية النكفية. عند إجراء تشريح حيواني كبير لاستعادة الحمض النووي الريبي ، من المفيد أن يكون لديك ثلاثة مشاركين على الأقل يعملون على الأنسجة الحيوانية.

سيكون التشريح الأول مسؤولا عن تقسيم الكبيرة لقطع مختلفة من ، وسيستعيد التشريح الثاني الغدد الليمفاوية من أقسام المختلفة في طاولة التشريح الرئيسية ، وسيعمل التشريح الثالث على طاولة منفصلة لعزل الأقسام من كل عقدة ليمفاوية ، ونقلها إلى أنابيب بمحلول حافظ. سنبدأ بتحديد وإزالة العقدة الليمفاوية قبل الكتف. من الناحية المثالية ، سيساعد ملامسة العقدة الليمفاوية ، قبل التشريح ، في تحديد موقع العقدة الليمفاوية.

على الرغم من أنه ليس من الممكن دائما اكتشافها ، إلا أن العقدة الليمفاوية قبل الكتف عادة ما تكون واضحة في سليم. ابدأ بوضع في الاستلقاء الجانبي. مد الكتف عن طريق تحريك الطرف الأمامي للخلف على مستوى الركبة.

ستعيد هذه الحركة الكتف إلى الوراء ، وتسمح بملامسة العقدة الليمفاوية بسهولة. اشعر بوجود العقدة الليمفاوية كما هو موضح. بمجرد تحديد موقعه ، ومع استمرار تمديد الكتف ، استخدم مشرط أو سكين تشريح لعمل شق جلدي على طول الخطوط العريضة للكتف.

اسحب الجلد للكشف عن نقطة عضلات الكتف والرقبة. لوحظ أحيانا جزء من الدهون تحت الجلد ، خاصة في شديدة التكييف. غالبا ما توجد العقدة الليمفاوية قبل الكتف مع أقسام من الدهون تحت الجلد.

هنا يمكنك رؤية الطبقات الثلاث من الجلد والعضلات والدهون تحت الجلد. مرة أخرى ، جس موقع العقدة الليمفاوية. على عكس الدهون تحت الجلد ، ستحتفظ العقدة الليمفاوية بشكلها عند تحسسها.

بعد تحديد موقع العقدة الليمفاوية قبل الكتف ، قم بتشريح الدهون تحت الجلد بعناية ، وقم بتشريح العقدة الليمفاوية. مظهر هذه الغدد الليمفاوية في البيسون ، والتي استخدمناها في دراسات داء البروسيلات بسبب قابلية البيسون في منطقة يلوستون الكبرى للبروسيلا ، متشابه. هنا ، نوضح مظهر العقدة الليمفاوية قبل الكتف ، كما تم تشريحها من الكتف الأيمن لثور أمريكي.

بعد ذلك سننتقل إلى عزل العقدة الليمفاوية النكفية. مع وجود في الاستلقاء الجانبي ، حدد موقع المفصل الصدغي الفكي. باستخدام مشرط أو سكين تشريح ، قم بعمل شق على الجلد بعناية.

ابدأ الظهر إلى المفصل ، وتمتد عموديا على طول خط الفك. قم بتشريح الجلد للكشف عن الأنسجة تحت الجلد. ستكون الغدة اللعابية النكفية مرئية ، أولا بسبب حجمها الكبير ومظهر سطحها المفصص ولونها الأحمر.

باستخدام الملقط والمشرط ، حرك الغدة اللعابية النكفية جانبا للعثور على العقدة الليمفاوية النكفية التي تجلس فقط في الجمجمة والإنسية للغدة اللعابية. عند عزل العقدة الليمفاوية النكفية ، من الضروري فصل أنسجة العقدة الليمفاوية عن أنسجة الغدة اللعابية النكفية. تبدو أنواع الأنسجة متميزة ، بما في ذلك داخل المقطع العرضي للأنسجة.

يمكن ملاحظة ذلك هنا ، مع وجود العقدة الليمفاوية النكفية على اليسار ، والغدة اللعابية النكفية على اليمين. تأكد من فحص أنسجة العقدة الليمفاوية النكفية بعناية بحثا عن الملمس قبل مزيد من المعالجة. في بعض الحالات ، قد يكون من الضروري استئصال الغدة اللعابية النكفية من أجل تحديد موقع العقدة الليمفاوية النكفية.

فيما يلي مثال على غدة نكفية مقطوعة من التوجيه ، حيث كانت العقدة الليمفاوية جزءا لا يتجزأ من الغدة اللعابية ولا يمكن رؤيتها قبل إزالة الغدة. يتم توفير معلومات إضافية حول تحديد الغدد الليمفاوية المختارة في المخطوطة الرئيسية. بمجرد جمع الغدد الليمفاوية ، تكون جاهزا لاستئصال الأقسام للحفظ.

استخدم مشرطا أو سكين تشريح ، وقم بإزالة جزء من العقدة الليمفاوية ، وقم بعمل قطع سهمي لفتح العقدة الليمفاوية. افحص الجزء الداخلي من العقدة الليمفاوية ، خاصة في عينات من المصابة ، بحثا عن عدم التناسق ، والآفات ، والاختلافات اللونية ، وما إلى ذلك. في هذه العقدة الليمفاوية قبل الكتف البقرية ، تظهر ميزات متعددة بالعين المجردة.

وتشمل هذه البصيلات التي تعد موطنا للخلايا الليمفاوية البائية ، والوحدات القشرية العميقة ، والتي تعد موطنا للخلايا التائية. تبدو هذه الأسباب أغمق من الجيوب الأنفية النخاعية ، وهي أفتح. هنا ، يتم تصوير مثال آخر على العقدة الليمفاوية غير المصابة.

هذه العقدة الليمفاوية من ثور البيسون الأصغر سنا. لاحظ أن البصيلات أقل تميزا في هذا المثال. من أجل تقسيم الأنسجة للمعالجة ، يتمثل أحد الخيارات في جمع قطع الأنسجة الصغيرة من كل عقدة ليمفاوية بمشرط لاستعادة الحمض النووي الريبي لاحقا.

ومع ذلك ، فإن أحد التحديات الرئيسية في مقارنة ملفات تعريف التعبير بين العينات هو الحجم الكبير للغدد الليمفاوية الحيوانية الكبيرة ، مقارنة بالعقدة الليمفاوية للفأر التي يمكن استخراجها بسهولة كاملة لاستخراج الحمض النووي الريبي. نتيجة لذلك ، لن تلتقط أقسام الأنسجة الصغيرة بشكل متساو ملف تعريف الخلايا عبر العقدة الليمفاوية. بدلا من ذلك ، لالتقاط الخلايا عبر ملف تعريف العقدة الليمفاوية ، قم باستئصال إسفين على شكل دائرية من العقدة الليمفاوية ، مقطعة إلى قطع صغيرة لا يزيد سمكها عن 5 مم ، ووضعها ، بالملقط ، في أنابيب تحتوي على الحمض النووي الريبي.

بدلا من ذلك ، استخدم منهجيات الخزعة لاستئصال أقسام الأنسجة من كل عقدة ليمفاوية. حدد أداة الخزعة المثقوبة إذا كنت ترغب في جمع أقسام معينة ، مثل بصيلات معينة من العقدة ، ثم نقلها باستخدام ملقط إلى RNAlater. بمجرد نقل العينات إلى الحمض النووي الريبي ، انقلها مرة أخرى إلى المختبر وخزنها عند 4 درجات مئوية طوال الليل للسماح باختراق الأنسجة.

بعد ذلك ، قم بضعف الحمض النووي الريبي الزائد وتخزين عينات الأنسجة عند 80 درجة مئوية. ميزة استخدام محلول حافظة الحمض النووي الريبي هي أن النيتروجين السائل غير مطلوب في التشريح ، ولا عند جمع العينات من الحقل. قبل الوصول إلى العينات ، قم بعمل كاشف Trizol قبل aliquot إلى الأنابيب للتجانس.

بعد إزالة العينات من الفريزر ، انقلها على الفور إلى كاشف Trizol للمعالجة اللاحقة ، بناء على توصيات الشركة المصنعة. هنا ، يتم نقل قطعة من 50-100 مجم من الأنسجة إلى كاشف Trizol. قلل من الذوبان قبل إضافة Trizol قدر الإمكان.

يمكن استخدام التخزين على الثلج الجاف عند إزالة عينات متعددة من الفريزر للمعالجة. ضع الأنابيب على الخالط ، وتجانس في كاشف Trizol. هنا ، يتم استخدام إعداد استخراج الحمض النووي الريبي لمدة دقيقتين.

عند الانتهاء، تحقق من وجود مظهر غائم. كرر إذا لزم الأمر. اتبع بروتوكول الشركة المصنعة لتوليد طبقات مائية وعضوية لكل عينة.

قم بإزالة المرحلة المائية العلوية الصافية بطرف ماصة. نقل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. بعد ذلك ، تخلط بحجم متساو من 100٪ من الإيثانول.

تخلط جيدا. غالبا ما يبدو الأنبوب غائما. باستخدام طرف ماصة دقيقة، انقل السائل إلى عمود دوران تجاري قائم على السيليكا لمزيد من تنقية الحمض النووي الريبي ثم التخلص منه.

لتقييم جودة الحمض النووي الريبي ، قم بتحميل لتر أو لترين من عينة الحمض النووي الريبي المملوثة إلى مقياس الطيف الضوئي لتحليله. بعد الانتهاء من الإجراء ، نلاحظ نسب امتصاص تبلغ حوالي اثنين لنسبة 260-280 ونسبة 260-230 ، مما يشير إلى نقاء عال مع الحد الأدنى من الترحيل الكيميائي. يمكن ملاحظة تلوث الفينول من انخفاض نسبة الامتصاص 260-230 نانومتر.

أثناء إجراء التشريح في حالة مثل البيسون ، لاحظنا فترة زمنية لا تقل عن 20 دقيقة بين القتل الرحيم ونقل عينة الأنسجة الأولى إلى مادة حافظة. في المقابل ، يمكن إزالة الغدد الليمفاوية للفأر وحفظها بعد القتل الرحيم في غضون دقائق. لذلك كنا مهتمين بتوصيف ملف تدهور الغدد الليمفاوية بمرور الوقت.

في المخطوطة الرئيسية ، قمنا أيضا بتجميع ملخص لملامح استقرار الحمض النووي الريبي في مجموعة من أنواع الأنسجة الأخرى التي تم اختبارها في منشورات أخرى. في التجارب التمثيلية ، التي أجريت على الغدد الليمفاوية البيسون ، كان استقرار الحمض النووي الريبي ثابتا نسبيا على مدار ساعة بعد القتل الرحيم. هنا ، نصور صورة هلامية لإجمالي الحمض النووي الريبي المنقى من قطع من أنسجة العقدة الليمفاوية فوق البراماماري من بيسون أمريكي.

تتوافق هذه النتيجة مع البيانات السابقة لأنواع الأنسجة الأخرى التي تم تجميعها من الأدبيات. يشير هذا إلى أنه يمكن جمع عينات ذات جودة مقبولة لتحليل المصب للتعبير الجيني حتى من الأنواع الأكثر تحديا مثل البيسون والأيائل. ومع ذلك ، من المهم أن نقدر أن الأوقات الأطول بين الموت والحفاظ على العينة يمكن أن تؤدي إلى تغييرات في ملفات تعريف تعبير الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك زيادة التحلل من ثلاثة نهايات رئيسية لنصوص mRNA.

لذلك لا يزال من المهم استخدام سير عمل سريع ومبسط لاستعادة الأنسجة من أجل تقليل المزيد من التأخير بمجرد توفر للتشريح ، من أجل تحقيق ملامح الحمض النووي الريبي الأكثر صحة بيولوجيا. بالإضافة إلى ذلك ، نلاحظ أنه يجب توخي الحذر طوال الإجراء لتجنب إدخال ملوثات الحمض النووي الريبي في العينات طوال العملية ، بخلاف تلك الموجودة بالفعل داخل الأنسجة. وهذا يشمل استخدام القفازات كجزء من معدات الحماية الشخصية الأخرى المطلوبة.

نقوم أيضا بتقسيم منتج الحمض النووي الريبي النهائي إلى أنابيب متعددة من أجل الحد من التوقف الحر لعينات الحمض النووي الريبي قدر الإمكان. على سبيل المثال ، يمكن تخزين حصصات منفصلة لاستخدامها في اختبارات مراقبة الجودة. باختصار ، قدمنا في هذا الفيديو معلومات مهمة لاستخدامها في تحديد الغدد الليمفاوية وجمعها وأخذ العينات التمثيلية ومعالجتها لتحليل التعبير الجيني النهائي.

بينما تم عرض الفيديو التمثيلي الخاص بنا مع أمثلة الماشية والبيسون ، فقد عملنا أيضا مع الغدد الليمفاوية من الأنواع الكبيرة الأخرى ، بما في ذلك الماعز والأيائل. نأمل أن تجد هذا الفيديو مفيدا في عملك ، سواء كنت عالما بيطريا يفكر في استخدام طرق النسخ في عملك ، أو عالم أحياء جزيئية مهتما بالمغامرة في مجال علوم الكبيرة.