تضمين البارافين وتمزيقها رقيقة من الأغشية الحيوية الميكروبية مستعمرة للتحليل المجهري

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء أقسام غشاء حيوي مدمجة في البارافين يمكن استخدامها لتقييم توزيع التعبير الجيني كما هو موضح عن طريق إنتاج البروتين الفلوري ضمن الأشكال الأصلية السليمة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في دراسة المجتمعات الميكروبية مثل كيفية التعبير عن جينات معينة في إنتاج مواد البوليمر الخارجية الموزعة في سياق بنية الأغشية الحيوية الأصلية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتحليل التعبير الجيني داخل التشكل المحفوظ للمقاطع العرضية للأغشية الحيوية مع كونها قابلة أيضا للعلاجات النهائية مثل تلطيخ السمات المميزة والتصوير عالي الدقة مثل الفحص المجهري متحد البؤر أو الإلكتروني.

بعد تحضير محلول أجار تريبتون وفقا لبروتوكول النص ، استخدم أنبوبا مخروطيا سعة 50 مليلتر لصب 45 مل من المحلول في طبق 100 ملم × 100 ملم مربع. اترك الأجار يتماسك لمدة 20 إلى 30 دقيقة تقريبا. صب طبقة ثانية مقاس 15 ملم فوق الطبقة الأولى ، ثم اتركها تتصلب طوال الليل ، وإذا لزم الأمر ، استخدم منديلا خاليا من النسالة لإزالة التكثيف من الأغطية.

بعد ذلك ، لاكتشاف الأغشية الحيوية للمستعمرة ، بعد زراعة مستعمرة واحدة معزولة من P.Aeruginosa من مخزون مجمد وفقا لبروتوكول النص ، قم بتعبئة الماصة من 2.5 إلى 10 ميكرولتر من تعليق الخلية على صفيحة متوسطة ثنائية الطبقة. يمكن تحضين المستعمرات في الظلام عند 25 درجة مئوية في رطوبة نسبية من 80 إلى 100٪ لمدة تصل إلى أربعة أيام. اسكب برفق 15 مل من محلول الأجار فوق وسط النمو والمستعمرة واترك الأجار بتكوين هلام في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، استخدم شفرة حلاقة حادة لقطع ظرف مربع من ثلاث طبقات مع المستعمرة مغلفة بين الطبقتين العلويين. في حالة تحضير عينات متعددة ، تأكد من قطع كل ظرف بحجم مماثل. قم بإزالة أي أجار زائد برفق من المستعمرة التي تحتوي على تشاك.

بعد ذلك ، بلل الرأس المسطح للملعقة في PBS أو الماء وأدخله برفق بين الطبقات العلوية والسفلية من الأجار. انقل المستعمرة المصفحة على الفور إلى شريط تضمين مكتوب عليه بقلم وسم مقاوم للمواد الكيميائية. ضع كاسيت التضمين في جهاز بريد منزلق زجاجي يحتوي على مثبت معد مسبقا.

معالجة العينات. استخدم 1X PBS لغسلها مرتين لمدة ساعة واحدة لكل منهما. للحصول على أفضل النتائج ، قم بأتمتة تجانس الكاشف باستخدام الإعداد المنخفض على وظيفة الدوران لمعالج الأنسجة التلقائي.

لتضمين العينات ، املأ قالب الشمع بشمع البارافين المنصهر المسخن إلى 55 درجة مئوية ، ثم استخدم ملعقة مسطحة ساخنة لنقل ظرف الظرف المتسلل بسرعة من كاسيت التضمين إلى قالب الشمع مع ضمان أن الظرف يستقر بالتوازي مع قاعدة القالب. اترك الشمع يتجمد طوال الليل عند أربع درجات مئوية. يمكن تخزين العينات المصبوبة بالشمع الصلب إلى أجل غير مسمى عند درجة الحرارة هذه.

بمجرد أن يصلب الشمع ، قم بإزالة العينة من القالب واستخدم شفرة حلاقة لتقليم الشمع الزائد من حول العينة. اترك بعض الشمع الممتد من أحد طرفي العينة الذي يمكن استخدامه لتثبيته في الميكروتوم. من المهم تقليم العينة المضمنة بالشمع بحيث يسهل شكلها جمع الأشرطة الخطية الملساء.

يمكن أن تؤدي العيوب الصغيرة في التشذيب إلى إنتاج قطع أثرية في الشريط وتعريض سلامة القسم للخطر. بعد ذلك ، قم بتسخين حمام مائي إلى 42 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتثبيت العينة في الميكروتوم مع توجيه سطح المستعمرة بشكل عمودي على حافة الشفرة.

قم بقص العينة على فترات 50 ميكرومتر حتى يتم الوصول إلى المستوى المطلوب للمستعمرة والتي سيتم من خلالها جمع الأقسام باستخدام ميكروتوم مضبوطة على سرعة تقسيم من 75 إلى 80 دورة في الدقيقة وزاوية خلوص من ست إلى 10 درجات. قص شريطا بالعدد المطلوب من الأقسام بسمك 10 ميكرومتر. بعد ذلك ، استخدم فرشاة طلاء ذات رؤوس دقيقة لفصل الشريط عن الشفرة.

الآن ، باستخدام ملقط أو قطرة ماء عند طرف ماصة باستور ، انقل الشريط برفق إلى الحمام المائي. أدخل شريحة على الفور في الحمام المائي وضعها أسفل الشريط بزاوية 45 درجة. المس الحافة الضيقة للشريط بالشريحة الموجودة أسفل الملصق المصنفر مباشرة.

يجب أن يلتصق الشريط. اسحب الشريحة للخارج من الحمام المائي واضبط الزاوية بحيث تكون عمودية على سطح الماء ، مما يسمح للشريط بوضعه بشكل مسطح على الشريحة بطوله. تجنب حبس الماء الزائد تحت الشريط.

ضع الشريحة برفق على منديل ماص خال من النسالة يمتص الماء الزائد من القسم. بعد ذلك ، ضع الشريحة على منشفة ورقية واتركها تجف في الظلام في درجة حرارة الغرفة طوال الليل. سخني صفيحة ساخنة مستوية إلى 45 درجة مئوية وضعي الشريحة على الطبق لمدة 30 إلى 60 دقيقة.

سيصبح الشمع شبه منصهر ومسطح ضد الشريحة. ارفع الشريحة برفق من اللوح الساخن وضعها بشكل مسطح على سطح أملس بدرجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة تقريبا حتى يتجمد الشمع. تأكد من أن الشمع المنصهر لا يسحب إلى أي من جانبي الشريحة.

مع وجود العينات داخل جهاز بريد منزلق زجاجي ، قم بإزالة الشمع من الشرائح في أربع غسلات من عامل المقاصة لمدة خمس دقائق لكل منها. استخدم شفاط Buchner لإزالة المحلول بين الغسل. استخدم 100٪ إيثانول لغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة دقيقة واحدة لكل منها.

بعد ذلك ، بعد إعادة ترطيب الشرائح وفقا لبروتوكول النص ، قم بتركيب الأقسام على الفور في وسط تثبيت مخزنة مؤقتا وقم بتطبيق غطاء. لا يتفاعل أجار التراكب حول القسم مع المثبت ، لذلك لا يلتصق بشريحة السلق. يمكن أن يزيح هذا الأجار أثناء الجفاف ويتلف القسم ، لذلك يجب توخي الحذر حتى لا يقلب المحلول أثناء الجفاف.

اسمح لوسط التركيب بالبلمرة في درجة حرارة الغرفة طوال الليل. بمجرد البلمرة ، استخدم طلاء الأظافر الشفاف لإغلاق الغطاء على الشريحة. أخيرا ، قم بتخزين الشرائح المختومة إلى أجل غير مسمى في الظلام عند أربع درجات مئوية.

في حين أن تصوير DIC باستخدام هدف غمر الزيت 40 مرة يمكن أن يكون كافيا لإظهار بعض السمات المورفولوجية للأقسام الرقيقة للأغشية الحيوية ، فإن المجهر الفلوري للسلالات المصممة للتعبير عن البروتينات الفلورية بشكل أساسي يوفر تصورا محسنا للتوزيع الخلوي داخل العينات. كما هو موضح في هذه اللوحات ، يمكن خياطة صور الأقسام الفردية معا لإنشاء مقطع عرضي للمستعمرة بأكملها وتوفر سياقا لتوطين السمات الهيكلية داخل التشكل العام على المستوى العياني يتيح استخدام سلالة مصممة للتعبير عن البروتين الفلوري تحت سيطرة محفز معين تصور توزيع التعبير الجيني.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن زراعة المستعمرات على وسط يحتوي على أصباغ ، أو يمكن إضافة الأصباغ بعد التقطيع إلى السكريات الخاصة بالبقع. أخيرا ، يمكن أيضا تحضير العينات وتصويرها بدقة أعلى باستخدام المجهر الإلكتروني للإرسال كما هو موضح هنا. من المهم عند محاولة هذا الإجراء أن تضع في اعتبارك تقلب العينات وإمكانية إدخال القطع الأثرية الفلورية والهيكلية إما من خلال التثبيت أو التقسيم أو الإماهة التي قد تؤثر على تفسيرك للبيانات.

يسمح هذا الإجراء بتحليل كمي للصور مثل ربط ملفات تعريف التعبير لمراسلي الفلورسنت بالسمات المورفولوجية والمحور Z للأغشية الحيوية. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على أنواع متنوعة من الميكروبات المكونة للأغشية الحيوية ذات الأهمية الطبية والصناعية مثل Pseudomonas aeruginosa و Vibrio cholerae و Bacillus subtilis. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية زراعة وإعداد الأغشية الحيوية للمستعمرة للتقسيم عبر تضمين البارافين.