تنويعات على سلبية وصمة عار أساليب الميكروسكوب الإلكتروني: أدوات للتصدي لتحدي الأنظمة

الهدف العام من هذا الفيديو هو إظهار العديد من الاختلافات المختلفة في تقنيات إعداد عينات المجهرية الإلكترونية لنقل البقع السلبية. البقعة السلبية هي أفضل طريقة لتقييم جودة عينة EM بسرعة. من المهم أن ندرك أن تقنيات إعداد الشبكة المختلفة تعمل بشكل أفضل مع بعض العينات.

يجب تحديد التقنية التي تعمل بشكل أفضل مع أي عينة معينة عن طريق التجربة والخطأ. للبدء ، قم بإعداد شبكات EM باستخدام طريقة ورقة الكربون وقم بإعداد كواشف التلوين السالبة كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. ضع شبكة EM مطلية بألواح الكربون متجهة لأعلى على شريحة مجهرية.

اضبط الشريحة في وحدة تفريغ التوهج وعالج الشبكة لمدة 30 ثانية على الأقل عند 10 مللي أمبير لجعل الشبكة محبة للماء. عند الانتهاء ، قم بإزالة العينة من وحدة التفريغ. بعد ذلك ، استخدم زوجا من ملاقط الضغط السلبي للإمساك بحافة الشبكة.

للتلطيخ باستخدام طريقة اللطخة الجانبية ، قم أولا بتطبيق ثلاثة إلى خمسة ميكرولترات من العينة على سطح الدعم. اسمح للعينة بالامتصاص على سطح الشبكة لمدة 10 ثوان إلى دقيقة واحدة ، ثم المس حافة الشبكة بورقة من ورق الترشيح واترك الحركة الشعرية لسحب السائل. بعد ذلك ، ضع 50 ميكرولتر قطرة من الماء عالي النقاء أو محلول عازل متطاير مناسب على ورقة من فيلم المختبر.

المس برفق سطح الكربون للشبكة إلى القطرة وارفع قطرة صغيرة على سطح الشبكة. بعد ذلك ، المس حافة الشبكة بورقة من ورق الترشيح واسمح للحركة الشعرية بسحب السائل. بعد ذلك ، ضع قطرتين سعة 50 ميكرولتر من كاشف التلوين على ورقة من فيلم المختبر.

المس برفق سطح الكربون للشبكة إلى القطرة وارفع قطرة صغيرة على السطح العلوي للشبكة. إذا هاجرت البقعة إلى الجزء الخلفي من الشبكة ، فقد تم كسر طبقة الكربون ويجب التخلص منها. بعد 10 إلى 15 ثانية ، المس حافة الشبكة بورقة من ورق الترشيح واسمح للحركة الشعرية بسحب السائل.

كرر خطوة التلوين هذه مرة أخرى ثم اترك الشبكة تجف في الهواء. لتلطيخ العينة باستخدام طريقة النقر ، أمسك حافة الشبكة بزوج من ملاقط الضغط السلبي وقم بتطبيق ثلاثة إلى خمسة ميكرولترات من العينة على سطح الدعم. أمسك الملقط بيد واحدة ، وقم بزاوية الشبكة بحيث تكون في حوالي 45 درجة متجهة بعيدا ونفض الغبار بسرعة عن المعصم لإخراج غالبية القطرة الموجودة أعلى الشبكة.

بعد ذلك، استخدم ماصة باستور زجاجية لوضع قطرة من محلول الغسيل على سطح الدعم. انقر فوق القطرة وكرر ذلك عدة مرات لغسل العينة. بعد ذلك ، ضع قطرة من كاشف التلوين على سطح الدعم وقم بنقر القطرة مرة أخرى.

كرر خطوة التلوين هذه من مرة إلى ثلاث مرات ، اعتمادا على عمق البقعة المطلوب لتصور العينة. قم بإزالة البقعة الزائدة عن طريق لمس الحافة الممزقة لقطعة من ورق الترشيح على حافة الشبكة ثم اترك الشبكة تجف في الهواء. لتلطيخ العينة باستخدام طريقة التنظيف السريع ، اسحب أولا 30 إلى 70 ميكرولترا من البقعة في طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر.

أدر قرص الصوت لسحب خمسة ميكرولترات من الهواء ثم اسحب خمسة إلى 30 ميكرولترا من كاشف الغسيل ، متبوعا بفجوة هواء صغيرة أخرى ، قبل خمسة ميكرولترات أخرى من العينة. أمسك حافة الشبكة بزوج من ملاقط الضغط السلبي وقم بزاوية الشبكة بزاوية 45 درجة تقريبا في مواجهة البعيد. بحركة واحدة سريعة، اخرج محتويات طرف الماصة بالكامل عبر وجه شبكة EM المطلية بالكربون.

قم بإزالة البقعة الزائدة عن طريق لمس الحافة الممزقة لقطعة من ورق الترشيح على حافة الشبكة واترك الشبكة تجف في الهواء. يعتمد الخيار المثالي للبقع السلبية بشكل كبير على العينة. البقعة الأكثر استخداما هي أسيتات اليورانيل ، ولكن يمكن أيضا استخدام بقع اللانثانيد.

بالنسبة للعينات المدمجة بعمق، أنتجت البقع القائمة على اللانثانيد، أسيتات الثوليوم وخلات الإربيوم، تلطيخا سلبيا بجودة مكافئة لأسيتات اليورانيل، كما يتضح من التباين الواضح والحدة للجزيئات الملطخة، حيث ينتج أسيتات الثوليوم صورا أكثر وضوحا ووضوحا من أسيتات الإربيوم. يصبح حجم الحبيبات الكبيرة لأسيتات الثوليوم واضحا عند التكبير العالي ، كما هو موضح هنا عندما تم تلطيخ عينة من جزيئات ليفي فسيفساء التبغ بنسبة 1٪ أسيتات الثوليوم. باستخدام أسيتات الثوليوم ، يمكن رؤية 23 أنغستروم تكرار الجسيم الليفي لفسيفساء التبغ بوضوح عن طريق العين.

لم تتمكن أي من بقع اللانثانيد الأخرى التي تم اختبارها من حل هذه الميزة. عينة أخرى يصعب تصويرها هي بروتين C المشتق من العضلات. تنتج هذه العينة صورا مختلفة بشكل كبير اعتمادا على طريقة التلوين.

عندما يتم تلطيخها بطريقة اللطخة الجانبية ، فإنها تظهر على شكل هيكل كروي يشبه الجناح المنهار. عندما يتم تحضير الشبكات بطريقة النقر ، يتم ملاحظة بروتين C كسلسلة من المجالات التي تشبه الخرز على خيط. هذا يمثل بشكل أفضل بنية بروتين C الفعلية.

بمجرد إتقانها ، لا يستغرق الأمر سوى حوالي دقيقة لتحضير عينة ملطخة سلبا. من المهم أن تتذكر أن كل عينة تستجيب بشكل مختلف لكل تقنية تلطيخ. بالنسبة للعينات الجديدة ، يجب تحديد أفضل نهج تجريبيا.

لا تنس أن كواشف تلطيخ اليورانيل سامة ومشعة قليلا. تأكد من التخلص منها في مجرى نفايات مناسب.