نظام ميكروبيوميتشانيكال لدراسة تشكيل فاريكوسيتي والانتعاش في محاور عصبية من الخلايا العصبية المركزية

الهدف العام من إعداد السوائل المضغوطة هذا هو إنتاج تورمات قابلة للتكرار ومتسقة على طول محاور الخلايا العصبية المستنبتة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال إصابات الدماغ مثل الآليات الكامنة وراء التغيرات المورفولوجية تحت الخلوية في الخلايا العصبية بعد الإصابة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الطريقة تنتج تغييرات مورفولوجية متسقة وقابلة للتكرار تتعافى بمرور الوقت.

هذه تقنية مهمة جدا طورناها في المختبر. هذا لأننا لا نستطيع فقط استخدام النظام لتحديد الآلية الجزيئية التي تحكم تغيير مورفولوجيا المحور العصبي الناجم عن الإجهاد الميكانيكي كشكل جديد من اللدونة العصبية ، ولكن أيضا استخدام النظام كأداة فحص لتحديد الأدوية الجديدة واستراتيجية العلاج لإصابات الدماغ الخفيفة أو المؤلمة. لبدء هذا الإجراء ، ضع صندوقا واحدا أو أكثر من أغطية 12 ملم أو 25 ملم في دورق زجاجي يحتوي على 70٪ من حمض النيتريك ، واحتضن الغطاء في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.

في اليوم التالي ، انقل جميع الأغطية إلى دورق سعة أربعة لترات مملوء ب 2.5 لتر من الماء المقطر المزدوج. رج الدورق الذي يحتوي على الغطاء لمدة ساعة واحدة بسرعة 100 دورة في الدقيقة ، ولا تنس استخدام الأربطة المطاطية لتثبيت الدورق أثناء الرج. بعد ذلك ، انقل الغطاء النظيف إلى قارورة جافة بغطاء معدني.

تخبز الأغطية في فرن على حرارة 225 درجة مئوية لمدة ست ساعات. ثم اتركها لتبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة واحفظها في وعاء بلاستيكي معقم حتى الاستخدام. الآن ، ضع غطاء واحد في كل بئر من لوحة 24 بئرا.

أضف 30 ميكرولترا من محلول طلاء الغطاء على غطاء ودوامة مقاس 12 ملم. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من PBS المعقم إلى كل بئر. يمكن استخدام اللوحة على الفور أو تخزينها عند أربع درجات مئوية في PBS معقم لمدة تصل إلى أسبوع واحد.

في يوم التشريح ، قم بإزالة PBS من اللوحة. جفف في الهواء وضع اللوحة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعتين إلى أربع ساعات. لفصل الخلايا العصبية في الحصين للثقافة ، قم بإذابة محلول إنزيم البروتياز وقم بتسخين وسط الطلاء مسبقا عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، اشطف الحصين المقطوع باستخدام SLDS. ثم قم بإزالته وأضف ملليلترين من محلول إنزيم البروتياز واحتضان العينة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل مستخلصات الحصين بخمسة إلى 10 ملليلتر من وسط الطلاء مرتين وأضف خمسة ملليلتر من وسط الطلاء.

قم بفصل مستخلصات الحصين إلى خلايا مفردة عن طريق توليد دوامة صغيرة باستخدام ماصة ذات طرف بلاستيكي سعة واحد ملليلتر. الماصة لأعلى ولأسفل حوالي 40 مرة لتجنب تكوين فقاعات الأكسجين حتى يصبح المحلول غائما ولا تبقى قطع كبيرة من النثرة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 1،125 مرة من الجاذبية لمدة ثلاث دقائق.

قم بإزالة المادة الطافية مع غمر الخلايا في وسط وأعد تعليق الخلايا في 145 مل من وسط الطلاء. ثم أضف ملليلتر واحد من تعليق الخلية لكل بئر إلى صفيحة سعة 24 بئرا. احتضان الخلايا في وسط الطلاء عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى أربع ساعات.

بعد ذلك ، قم بإزالة وسيط الطلاء واستبدله بوسيط صيانة جديد. بعد يومين ، استبدل نصف الوسط باثنين من RSC الميكرومولار المذاب في وسط الصيانة لمنع نمو الخلايا الليفية والبطانية والدبقية. ثم ، بعد تعريض الخلايا ل RSC لمدة يومين ، استبدل الوسيط بوسيط صيانة جديد.

لتحويل المظهر لتصور مورفولوجيا الخلية ، قم بتخفيف البناء من المخزون بمعدل ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر في وسط Opti-MEM والدوامة. بعد ذلك ، قم بتخفيف كاشف التعداء بوساطة الجسيمات الشحمية في وسائط Opti-MEM والدوامة. بعد ذلك ، قم بإعداد تخفيف بناء واحد وتخفيف تعدي واحد لكل بئر.

بعد ذلك ، قم بإعداد خليط واحد لواحد من وسيط البناء و Opti-MEM وكاشف التعدي ووسط Opti-MEM والدوامة. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. بعد 20 دقيقة ، قم بإزالة نصف الوسط من كل بئر وانقل هذا الوسيط إلى أنبوب مخروطي نظيف.

احتفظ بالأنبوب في الحاضنة ، ثم أضف 100 ميكرولتر من الخليط المحضر في الخطوة السابقة إلى الوسط المتبقي في البئر. اسمح للخلايا بالتحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة. أثناء الحضانة ، أضف حجما واحدا من وسط الصيانة الطازجة إلى الوسط في الأنبوب المخروطي وضع الخليط في نفس الحاضنة.

بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسائط التي تحتوي على محلول التعدي من الآبار واستبدلها بمزيج واحد لواحد من وسط الصيانة القديم والطازج في الأنبوب المخروطي. في هذا الإجراء، أدخل الماصة في الجزء العلوي اللولبي من المعالج الدقيق لتثبيتها في مكانها. قم بلف المسمار المعدني ذو السطح المسطح المتصل بذراع الملاعب الدقيقة بحيث يثبت الطرف غير المسحوب للماصة فوق مكان توصيل الأنبوب المطاطي مباشرة.

قم بزاوية الماصة بزاوية 45 درجة مع سطح الخلية العصبية التي تحتوي على أغطية. قم بتشغيل مرشح الإزهار. افتح الفتحة ، وتأكد من رؤية بقعة الفلورسنت قادمة من خلال الهدف.

باستخدام المعالج الدقيق، حرك الماصة إلى موضع يصطف الطرف مع بقعة الفلورسنت وقم بخفض الماصة إلى موضع أعلى مباشرة من ارتفاع طبق زراعة الخلية. بمجرد أن يصبح في موضعه ، قم بتشغيل الضوء المرسل وإيقاف تشغيل الإزهار. باستخدام الملقط ، انقل غطاء واحد بحيث تكون الخلايا متجهة نحو الماصة من لوحة زراعة الخلية إلى طبق زراعة الخلية الذي يحتوي على 2 مل من عازلة هانك في درجة حرارة الغرفة.

باستخدام مقبض التركيز البؤري الدقيق والهدف 20 ضعفا ، ركز على مستوى حوالي أربع لفات كاملة فوق الخلايا. بعد ذلك ، استخدم المعالج الدقيق لوضع طرف الماصة بحيث يتم تركيزه وفي الجانب الأيسر الأوسط من المستوى كما يرى من خلال العدسات. بمجرد أن تصبح الماصة في موضعها ، ركز المجهر على مستوى يحتوي على منطقة الاهتمام.

في تصوير سبعة أقسام ، أظهرت الخلايا العصبية في الحصين الفأرية المنقولة GFP محورا عصبيا قبل وبعد النفخ ، بالإضافة إلى فترة نقاهة مدتها 10 دقائق. هنا هو التصوير بفاصل زمني لنفس الخلية العصبية. تشير الأسهم الحمراء إلى الدوالي التي تشكلت بعد 150 ثانية من 190 مليلتر من نفخ H2O ، بدءا من 30 ثانية.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تسجيل الخلية بأكملها ، وتصوير FRET و TIRF بفاصل زمني ، وتصوير الكالسيوم من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تأثيرات الإجهاد الميكانيكي على الإشارات العصبية والكهربائية والكالسيوم ، وتهريب البروتين والتفاعلات. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في إصابات الدماغ الرضحية الضوئية لشرح الآليات الجزيئية الكامنة وراء تكوين الدوالي المحورية في الخلايا العصبية الحية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء التجارب لدراسة الإحساس الميكانيكي للخلايا العصبية المركزية.