زرع صفحة الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية للحد من تسرب بعد Colectomy الجزئية في نموذج الفئران

لأنها تفترض تأثيرا إيجابيا على شفاء الأنسجة ، فقد تم اختبار صفائح ASC في العديد من نماذج الأمراض ، مثل احتشاء عضلة القلب. تظهر هذه التجربة أنه يمكن استخدام صفائح ASC داخل البطن وتطبيقها على الأمعاء. الميزة الرئيسية لألواح ASC هي عدم الحاجة إلى مواد اصطناعية.

بالإضافة إلى ذلك ، من السهل نسبيا إجراء عملية زرع ورقة ASC ، مع قدر صغير من الممارسة. تم تطوير هذا التطبيق الجديد لزراعة صفائح ASC لمنع التسرب بعد استئصال الأمعاء ، ويقدم خطوة أولى لاستراتيجية علاجية جديدة. ثبت أن صفائح ASC المطبقة على مفاغرة الأمعاء واعدة في منع التسرب.

يمكن أيضا تطبيق صفائح ASC على أعضاء أخرى داخل البطن ، مثل المسالك البولية. ابدأ بتشريح الأنسجة الدهنية للبطن تحت الجلد إلى قطع بحجم 0.5 سم ، بشفرة جراحية معقمة مقاس 10 ، وملقط أنسجة Adson-Brown ومقص Metzenbaum. قم بوزن الكمية الإجمالية للأنسجة المقطوعة في زجاجة زجاجية معقمة.

أضف 30 مل من وسط العزل لكل زجاجة. وهضم الأنسجة الدهنية المقطعة في حاضنة شاكر عند 150 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ساعة ، قسم محلول الأنسجة المهضومة إلى أنابيب سعة 50 مل ، وقم بالطرد المركزي للأنابيب لمدة 10 دقائق عند 390 جم ، وبعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية.

أضف وسيطا لإعادة تعليق كريات الخلية ، وأضف المزيد من وسط الثقافة ، حتى 45 مل. قم بالطرد المركزي للخلايا المدمجة لمدة خمس دقائق عند 390 جم وقم بإزالة المادة الطافية. أعد تعليق حبيبات الخلية ب 10 مل من وسط الاستزراع.

وقم بتصفية تعليق الخلية من خلال مرشح 100 ميكرون. أضف 50 لترا من محلول الميثيلين الأزرق الحمضي بنسبة 3٪ ، إلى 50 لترا من معلق الخلية ، لقمل خلايا الدم الحمراء. بعد خلط المحلول ، قم بتقطيع الماصة 10 لتر على مقياس كثافة الدم ، وعد الخلايا.

قم بلوحة الخلايا بكثافة 40000 خلية لكل سم مربع ، في قارورة T175 تحتوي على وسط ثقافة. واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو رطب مع 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، اغسل الخلايا بمحلول ملحي دافئ مخزن بالفوسفات لإزالة بقايا الخلايا.

بعد ذلك ، استبدل الوسط بوسط استزراع FBS بنسبة 10٪ ، بالإضافة إلى حمض الأسكوربيك -2-فوسفات المضاف حديثا وعامل نمو الخلايا الليفية المؤتلف البشري الثاني. احتضان حتى تصل الخلايا إلى 90٪ التقاء. زراعة الخلايا الجذعية الدهنية عند التقاء 90٪ ، باستخدام محلول Trypsin-EDTA القياسي 0.25٪.

بعد ثلاث إلى خمس دقائق ، قم بتحييد محلول 0.25٪ Trypsin-EDTA مع 10 مل من وسط الاستزراع. انقله إلى أنبوب طرد مركزي ، وقم بالطرد المركزي للخلايا لمدة ثماني دقائق عند 250 جم ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسط الثقافة. بعد عد الخلايا باستخدام مقياس الدم ، قم بتقطيع الخلايا في قوارير ثقافة T175 ، بكثافة 8000 خلية لكل سم مربع.

قم بتجميد ASCs المتبقية في النيتروجين السائل ، مع 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد في وسط الاستزراع قبل الاستخدام الآخر. قم بتغطية أطباق الاستزراع المستجيبة للحرارة بقطر 3.5 سم ، مع 1 مل من مصل الأبقار الجنينية. ثم ضع الأطباق في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية ، لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل البذر.

للمساعدة في التصاق ASC بالطبق المستجيب للحرارة ، وتقليل خطر انفصال صفائح ASC المبكر في الثقافة ، يجب طلاء الطبق المستجيب للحرارة مسبقا بمصل بقري الجنين قبل بذر الخلايا. قم بتربسين ASCs كما كان من قبل ، إذا كان هناك أي كتل خلوية بعد التربسين ، فقم بتصفية الخلايا من خلال مرشح 100 ميكرون قبل العد. أخرجي الأطباق من الحاضنة وانقليها إلى طبق تسخين عند 37 درجة مئوية.

قم بإزالة FBS من الطبق. بعد إعادة تعليق الحبيبات الخلية في LG DMEM ، مع 10٪ FBS ، وعد الخلايا ، قم بتخفيف 3.52 مرة 10 إلى ASCs 6 في 2 مل من وسط الاستزراع لكل طبق ، لزرع 400000 خلية لكل سم مربع في كل طبق 3.5 سم. قم بتوزيع الخلايا بعناية بالتساوي قدر الإمكان ، عن طريق تأرجح الطبق برفق.

بعد ذلك ، قم بزراعة صفائح ASC لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو رطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في يوم الزرع ، اترك أطباق الثقافة تبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل 40 دقيقة من الزرع في الجسم الحي لتسهيل انفصال ورقة ASC. بمجرد أن يبرد ، قم بإزالة وسط الاستزراع ، واستبدله ب 1 مل من LG DMEM الخالي من المصل.

لزرع ورقة الخلية ، أمسك حافة ورقة ASC برفق باستخدام ملقط غير رضحي وضع جانب الطبق من ورقة ASC أعلى خط مفاغرة. يعد التعامل اللطيف مع الملاءات ووضع الملاءات بشكل صحيح أمرا ضروريا لضمان نجاح عملية زرع الألواح السليمة. قم بتمديد ورقة ASC بعناية إلى حوالي 0.25 سم فوق وتحت الخط المفاغر.

لف الورقة حول القولون ، وارفع القولون ، للف ورقة ASC حول الجانب الظهري. تظهر الضابطة ، التي لم تتلق صفائح ASC المزروعة ، تسرب البراز بالقرب من خط مفاغرة ، يشار إليه بالسهم الأبيض في اليوم الثالث بعد الجراحة. أظهرت تلك ذات صفائح ASC المزروعة ، المشار إليها بالسهم الأسود ، انخفاضا في تسرب البراز وتكوين الخراج في اليوم الثالث بعد الجراحة.

لوحظت نفس النتيجة بعد سبعة أيام من الجراحة. تظهر هذه الصورة مقطعا عرضيا تمثيليا لموقع مفاغرة القولون والمستقيم في مزروع ملطخ ب H و E.يمكن تحديد بنية الصفيحة في موقع مفاغرة ، حتى سبعة أيام بعد الجراحة. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في بضع دقائق إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.

سوف تلتصق ورقة ASC تلقائيا بسطح الخلية الصفرية للقولون ، وليست هناك حاجة لاستخدام الغراء أو الخيط لتناسب ورقة ASC. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير وزرع صفائح ASC على مفاغرة القولون والمستقيم في الفئران ، لمنع التسرب بعد استئصال القولون الجزئي.