عزل خلايا ماست المستمدة من الغشاء البريتوني وعلى التوصيف الوظيفي مع Ca^{2 +}-التصوير وفحوصات تحبب

يمكن أن تساعد هذه الطرق في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الإشارات داخل الخلايا على الخلايا القابلة للاستثارة ، مثل القنوات الأيونية الحاسمة لتنشيط الخلايا المناعية وإطلاق الوسيط. المزايا الرئيسية لهذه التقنيات هي بساطتها النسبية وإمكانية التحليل المتزامن لعدد كبير من الخلايا. ستظهر تصوير الكالسيوم Fura-2 في الخلايا البدينة كاثرين أولينشلاجر ، طالبة دراسات عليا من مختبري.

لبدء هذا الإجراء ، رش الفأر القتل الرحيم بنسبة 70٪ من الإيثانول وقم بإصلاحه على كتلة رغوية مع جانبها الظهري لأسفل باستخدام دبابيس. باستخدام مقص حاد الحواف ، قم بإزالة الجلد فوق بطن الفأر وتجنب إتلاف التجويف البريتوني. بعد ذلك ، قم بحقن سبعة ملليلتر من وسط RPMI المثلج في التجويف البريتوني عن طريق إدخال إبرة قياس 27 بعناية في الصفاق.

لا تثقب أي أعضاء ، واستخدم بقعة في منطقة الدهون البربخية لتقليل خطر حدوث ثقب في الأعضاء. بعد الحقن ، هز الماوس لمدة دقيقة واحدة لفصل الخلايا البريتونية عن وسط RMPI. لا تهز الماوس بقوة لتجنب إتلاف الأعضاء الداخلية وتلويث التجويف البريتوني بالدم.

بعد ذلك ، أعد استخدام المحقنة عن طريق تجهيزها بقنية جديدة قياس 20. حرك الأعضاء الداخلية إلى جانب واحد عن طريق إمالة كتلة الرغوة والنقر عليها برفق على المقعد لتسهيل الشفط المتوسط من الجانب الآخر. بعد ذلك ، أدخل إبرة مائل قياس 20 لشفط السائل من البطن برفق وببطء لتجنب انسداد الأعضاء الداخلية.

اجمع أكبر قدر ممكن من السوائل. ثم قم بإزالة الإبرة من المحقنة وانقل تعليق الخلية المجمعة في أنبوب تجميع على الجليد. تخلص من أنبوب العينة إذا كان هناك تلوث دم مرئي.

جهاز الطرد المركزي للأنبوب بتعليق خلية نظيفة عند 300 جم لمدة خمس دقائق. تحت غطاء معقم ، استنشق المادة الطافية. أعد تعليق عينة الكريات في وسط PMC البارد وانقل تعليق الخلية إلى قارورة زراعة خلية مساحتها 25 سم مربع.

بعد ذلك ، أضف عوامل النمو IL-3 و SCF إلى التركيزات النهائية البالغة 10 نانوغرام لكل مليلتر و 30 نانوغرام لكل مليلتر ، على التوالي. احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة تقريبا عند 37 درجة مئوية حتى الإجراء التالي. في الأيام من 12 إلى 15 ، إذا تم التخطيط لأي تجارب مع تحفيز مستقبلات IgE البلازمية ، فقم بمعالجة الخلايا بين عشية وضحاها باستخدام 300 نانوجرام لكل مليلتر من IgE المضاد ل DNP في وسط الثقافة القياسي.

لتحضير تصوير Fura-2 ، قم بتخفيف محلول مخزون Fura-2 و AM في HBSS من الكالسيوم إلى تركيز نهائي يبلغ خمسة ميكرومولار من أجل تحضير مخزن التحميل. بعد ذلك ، امزج 500 ميكرولتر من مخزن التحميل مع 500 ميكرولتر من تعليق خلية PMC. قم بعرض الخليط في غرفة التصوير واحتضان الخلايا لمدة 20 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.

قم بإعداد نظام التطبيق الذي يتم تغذيته بالجاذبية بحلول مختلفة وفقا لبروتوكول التحفيز. بعد ذلك ، قم بتركيب نظام التطبيق على مسرح المجهر المقلوب. قم بإعداد هدف غمر الزيت بفتحة عالية 40X عن طريق وضع قطرة صغيرة من زيت الغمر عليه.

ضع حجرة التصوير مع الخلايا المحملة في نظام التطبيق وقم بتثبيتها لمنع الحركة أثناء التسجيل. ثم قم بتشغيل الضوء المرسل والتركيز على الخلايا. بعد ذلك ، ابدأ برنامج اكتساب التصوير في وضع الاستحواذ الفسيولوجي.

افتح نافذة الإعداد واضبط التركيز ووقت الاكتساب الأمثل. صور صورة مرجعية وقم بتمييز الخلايا كعائد استثمار. حدد آخر عائد استثمار في منطقة لا توجد بها خلايا وقم بتعريفها على أنها خلفية.

بعد ذلك ، أكمل الإعداد وابدأ القياس بمعدل اكتساب مدته خمس ثوان. بعد ذلك ، أضف الحلول برقم الدورة المناسب وفقا لتصميم التجربة. لقياس الارتفاع الناجم عن المستضد لتركيز الكالسيوم داخل الخلايا ، ضع محلول المحقنة الثانية بعد الدورة 20 وتوقف عن التسجيل بعد الدورة 150.

لقياس ارتفاع تركيز الكالسيوم داخل الخلايا الناجم عن المركب 48/80 ، ضع محلول المحقنة الثالثة بعد الدورة 20 وتوقف عن التسجيل بعد الدورة 150. لقياس ارتفاع تركيز الكالسيوم داخل الخلايا الذي أثارته SOCE ، قم بتطبيق محلول المحقنة الأربعة بعد الدورة 10 ، وقم بتطبيق محلول الحقنة الخمسة بعد الدورة 70 ، وقم بتطبيق محلول المحقنة الأربعة بعد الدورة 120 ، وقم بتطبيق محلول المحقنة الواحدة بعد الدورة 150 ، وتوقف عن التسجيل بعد الدورة 220. في برنامج الاستحواذ ، اضغط على التوالي على الأزرار Start Cutter ، و Mark All ، و Convert All ، و Physiology Measurements ، و OK ، ثم OK مرة أخرى.

احفظ الملفات كجداول ومكدسات صور لتحليلها دون اتصال. لقياس إطلاق بيتا هيكسوسامينيداز ، انقل 100 ميكرولتر من معلق الخلية لكل بئر إلى لوحة بئر ذات قاع V سعة 96 بئرا. أضف 25 ميكرولترا من محلول التحفيز أو التحكم لكل بئر.

ثم احتضان الخلايا لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، أوقف التفاعل عن طريق وضع الصفيحة المكونة من 96 بئرا على الجليد لمدة خمس دقائق. ثم ، قم بالطرد المركزي للوحة عند أربع درجات مئوية لمدة أربع دقائق عند 120 جم.

انقل 120 ميكرولترا من المادة الطافية إلى طبق مسطح القاع مكون من 96 بئرا وضعه على الثلج. تجنب بعناية لمس كريات الخلية ، ولكن استنشق المادة الطافية تماما. بعد ذلك ، أضف 125 ميكرولتر من محلول التحلل إلى كريات الخلية.

احتضان كريات الخلية لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وأعد تعليقها بعد الحضانة عن طريق سحب العينات المتكرر. ماصة 25 ميكرولتر من محلول pNAG سعة أربعة ملليمولار في الآبار المطلوبة للوحة جديدة مسطحة القاع مكونة من 96 بئرا. أضف 25 ميكرولترا من كل مادة طافية و 25 ميكرولترا من كل محللة خلية بشكل منفصل إلى محلول pNAG المحضر.

احتضان دفعات التفاعل لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، قم بتعبئة 150 ميكرولتر من محلول التوقف لكل بئر لإيقاف التفاعل. بعد ذلك ، قم بتحليل امتصاص ضوء عينة اللوحة باستخدام قارئ اللوحة الدقيقة عند 405 نانومتر مع المرجع 630 نانومتر للطرح التلقائي للخلفية.

في برنامج الاستحواذ ، حدد المربع مرجع ، وفي قائمة عنصر برنامج الامتصاص ، حدد 630 نانومتر للطرح التلقائي للخلفية. تم إجراء مقايسة إطلاق بيتا هيكسوسامينيداز لاختبار قدرة PMCs المعزولة التي تخضع للتحلل عند تشابك مستقبلات IgE عالية التقارب أو تحفيز مستقبلات Mrg PRB2. تمت إضافة الخلايا إلى صفيحة 96 بئر ذات قاع V وتم تحفيزها وفقا لهذا المخطط لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

بعد الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية ، تم تحلل الكريات. ثم تم تحليل محتوى بيتا هيكسوسامينيداز للطافات الفردية ومحاللات الحبيبات من خلال تفاعلاتها مع pNAG خلال حضانة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. تم الكشف عن كمية نواتج التفاعل لونيا وتم حساب النسبة المئوية لبيتا هيكسوسامينيداز الذي تم إطلاقه.

كان الإطلاق التلقائي منخفضا جدا ، في حين أن الاستجابات لمحفزات التحلل القوية ، مثل 10 ميكرومولار الأيونومايسين والمركب 48/80 عند 50 ميكروغرام لكل مليلتر ، كانت أكثر من 40٪ و 60٪ على التوالي. كانت استجابات التحلل لتحفيز DNP تعتمد على الجرعة على نطاق تركيز من 10 إلى 300 ملليغرام لكل مليلتر. تشير هذه البيانات معا بوضوح إلى حالة وظيفية جيدة للشركات العسكرية الخاصة المعزولة.

باستخدام هذه التقنية ، ستحصل على مجموعة نقية للغاية من خلايا النسيج الضام الناضجة للفئران المشتقة من الصفاق في غضون أسبوعين. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على ظروف معقمة أثناء عزل الخلايا وزراعتها لتجنب التلوث البكتيري. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل قياسات تيار أيون المشبك الكهربية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بمسارات دخول الكالسيوم في الخلايا البدينة.

بعد تطويرها ، مهدت تقنية تصوير الكالسيوم داخل الخلايا Fura-2 الطريق للباحثين في مجال فسيولوجيا الخلايا الكتلية لاستكشاف اعتماد الكالسيوم لتحلل الخلايا البدينة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تجارب تصوير الكالسيوم Fura-2 ومقايسة تحلل بيتا هيكسوسامينيداز مع الخلايا البدينة. لا تنس أن العمل مع الأشعة فوق البنفسجية يمكن أن يكون خطيرا على العينين والجلد ، ويجب تجنب التعرض غير الضروري أثناء تنفيذ هذا الإجراء.