اليكتروتشيميلومينيسسينسي فحوصات للأجسام المضادة البشرية من جزيرة ليلى

الهدف العام من اختبار التلألؤ الكيميائي الكهربائي هذا هو الكشف عن الأجسام المضادة للجزيرة في مرض السكري من النوع الأول من المناعة الذاتية ، بحساسية عالية وخصوصية عالية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال مرض السكري من النوع الأول ، مثل وقت بدء المناعة الذاتية في الجزيرة والتنبؤ بالمخاطر العالية لمرض السكري من النوع الأول. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أكثر حساسية وأكثر تحديدا للمرض وغير مشعة مقارنة بالمقايسات الإشعاعية القياسية الحالية.

يمتد تأثير هذه التقنية إلى التنبؤ بمرض السكري من النوع الأول وتشخيصه لأن هذه الأجسام المضادة الذاتية للجزيرة تظهر قبل أشهر إلى سنوات من المرض السريري المصحوب بأعراض. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتشخيص مرض السكري من النوع الأول ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا لدراسة أمراض المناعة الذاتية الأخرى ، مثل الأجسام المضادة الذاتية لترانسجلوتاميناز لمرض الاضطرابات الهضمية إلى TPO والثيروجلوبولين لأمراض الغدة الدرقية المناعية الذاتية والعديد من الأمراض الأخرى. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما وجدنا أن هذه التقنية تعتمد على حساسية عالية وغير نشاط إشعاعي.

على عكس طريقة ELISA التقليدية التي لا تعمل بشكل جيد لأي اكتشاف للأجسام المضادة الذاتية للجزيرة. يعد العرض البصري لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب وصف فحص الأجسام المضادة الذاتية للأنسولين مع العلاج بحمض المصل في النص. سيوضح الإجراء يونغ غو ، باحث ما بعد الدكتوراه من مختبري.

أولا ، امزج المستضد الذاتي للجزيرة البشرية مع البيوتين أو SULFO-TAG بنسبة واحدة إلى خمسة مولية في أنبوب. وقم بتغطية الأنبوب بورق الألمنيوم لأن كلا العلامتين حساستان للضوء. ثم احتضان الأنبوب لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.

في غضون ذلك ، عندما تكون الحضانة جارية ، قم بتشغيل عمود الدوران بمحلول ملحي مخزن بفولتين من الفوسفات. ثم ، قم بالطرد المركزي للعمود عند 1 ، 000 مرة من الجاذبية لمدة دقيقتين في كل مرة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لخليط علامة المستضد الذاتي في عمود الدوران عند 1 ، 000 مرة من الجاذبية لمدة دقيقتين.

بعد ذلك ، قم بتخزين المستضد المسمى وتخزينه عند سالب 80 درجة مئوية. بعد ذلك ، استخدم التركيز المنطقي للمستضد المسمى بالبيوتين SULFO-TAG بناء على مقايسة رقعة الشطرنج للمخزن المؤقت للمستضد ، لتحضير ثلاثة ملليلتر من محلول المستضد لكل لوح 96 بئرا. ثم ، في كل بئر ، أضف أربعة ميكرولترات من المصل واضبط الحجم النهائي على 20 ميكرولتر باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات.

ثم أضف 20 ميكرولترا من محلول المستضد المسمى في كل بئر. وقم بتغطية اللوحة بورق مانع للتسرب يمنع الضوء. ثم انقل الطبق على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.

بمجرد توقف الخلاط ، اترك الطبق عند أربع درجات مئوية في الثلاجة لمدة 18 إلى 24 ساعة. الآن ، امزج 15 ميكرولترا من المصل مع 18 ميكرولترا من حمض الخليك 0.5 مولار لكل عينة واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. على أساس مقايسة رقعة الشطرنج ، استخدم التركيز المنطقي للمستضد المسمى البيوتين SULFO-TAG لتحضير محلول المستضد.

بعد ذلك ، قم بتناول 35 ميكرولترا من المخزن المؤقت للمستضد في كل بئر من لوحة PCR جديدة. قبل اكتمال فترة حضانة خليط المصل مباشرة ، أضف 3.8 ميكرولتر من محلول تريس مولار واحد عند درجة الحموضة تسعة ، بجانب كل بئر على لوحة المستضد. بمجرد انتهاء الحضانة ، انقل بسرعة 25 ميكرولترا من المصل المعالج بحمض الأسيتيك في كل بئر من لوحة المستضد وقم بتحريك المحلول.

بعد ذلك ، قم بتغطية لوحة PCR بورق مانع للتسرب لتجنب الضوء وضعها على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بمجرد الانتهاء من ذلك ، انقل الطبق على أربع درجات مئوية في الثلاجة واحتضنه لمدة 18 إلى 24 ساعة. أخرج طبق الستربتافيدين من الثلاجة عند أربع درجات مئوية واترك الطبق يصل إلى درجة حرارة الغرفة.

بعد أن تصل لوحة الستربتافيدين إلى درجة حرارة الغرفة ، أضف 150 ميكرولتر من 3٪ مانع A في كل بئر وقم بتغطية لوحة PCR بورق مانع للتسرب واحتضانها في الثلاجة طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بإزالة صفيحة الستربتافيدين من الثلاجة وطرد العازل من الآبار. بعد ذلك ، جفف الطبق عن طريق وضعه رأسا على عقب على بعض المناشف الورقية حتى ينقع المخزن المؤقت المتبقي.

ثم أضف 150 ميكرولترا من المخزن المؤقت PBST ذو الطية الواحدة لغسل البئر لثلاث غسلات متتالية. بعد ذلك ، قم بنقل 30 ميكرولترا من مستضد المصل المحتضن في كل بئر من صفيحة الستربتافيدين وقم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم لتجنب الضوء. ثم انقل الطبق على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة.

بعد ساعة واحدة ، تخلص من مستضد المصل ، واحتضن من اللوحة وأضف 150 ميكرولترا من المخزن المؤقت PBST ذو الطية الواحدة لغسل البئر ثلاث مرات. بمجرد انتهاء الغسيل ، أضف 150 ميكرولترا من مخزن القراءة إلى كل بئر للقراءة على قارئ اللوحة. قبل تحليل أي عينات غير معروفة ، تم إعداد قطع الفحص لكل اختبار للأجسام المضادة الذاتية من خلال اختبار حوالي 100 مريض بمرض السكري من النوع الأول وحوالي 100 عنصر تحكم صحي.

بعد ذلك ، تم رسم منحنى ROC لتحديد المؤشر الأمثل للحد الأعلى للحد الطبيعي لمقايسة GADA ، والذي كان 0.023 ، وذلك للحصول على أفضل حساسية وخصوصية. ثم تم حساب نتيجة العينة المجهولة باستخدام معادلة مشتقة من معايير تحكم عالية إيجابية ومنخفضة إيجابية وسلبية. بعد ذلك ، تم رسم رسم بياني لتحديد الإشارات التي تم الحصول عليها في اختبار الجسم الذاتي للجزيرة عند احتضان الجسم المضاد أحادي النسيلة للأنسولين مع مصل بشري طبيعي في وجود وعدم وجود العلاج الحمضي.

تظهر المؤامرة أن الإشارة محظورة بشكل ملحوظ عند إضافة المصل الطبيعي في حالة عدم وجود معالجة حمضية. على العكس من ذلك ، تكون الإشارة التي تم الحصول عليها أعلى نسبيا عندما يخضع المصل للمعالجة الحمضية قبل الحضانة بالجسم المضاد أحادي النسيلة للأنسولين. كما تم رسم رسم بياني مماثل لتحديد الإشارات التي تم الحصول عليها باستخدام مصل المريض الأجنبي في وجود وعدم وجود العلاج الحمضي.

إن علاج مصل المريض بالحمض قبل الحضانة بالجسم المضاد يزيد بشكل كبير من الإشارات في فحص الأجسام المضادة الذاتية للجزيرة عند مقارنتها في حالة عدم وجود علاج. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية بسهولة لعدة مئات من العينات في يوم واحد إذا تم تشكيلها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إجراء اختبار رقعة الشطرنج لكل اختبار للجسم المضاد الذاتي لتحسين حالة الفحص.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال مرض السكري من النوع الأول من المناعة الذاتية للتنبؤ والوقاية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لمدى سهولة إجراء هذا الفحص. لا تنس أن العمل مع عينات المصل يمكن أن يكون خطيرا ومعديا.

يجب دائما اتخاذ الاحتياطات لتجنب ملامسة الجلد المباشرة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.