مخصص تصميم قوالب زراعة الأنسجة من سادة ليزر محفوراً

يمكن أن تسهل هذه الطريقة البحث في مجال هندسة الأنسجة المتعلق بتطوير الأنسجة ومحاذاة الخلايا والتحليل الميكانيكي للبوليمرات والأنسجة الهندسية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها منخفضة التكلفة وسهلة الاستخدام وسريعة. لقد طورنا هذه التقنية في مختبري لأن التحكم الهندسي في الأنسجة المهندسة على مقياس المليمتر إلى السنتيمتر لم يكن يتم في هذا المجال ، ورأينا حاجة ماسة للتفكير بشكل مترجم في توسيع حجم الأنسجة الهندسية.

تتيح لنا هذه التقنية الاستفادة من فوائد قوائم الانتظار الهندسية على علم وظائف الأعضاء الخلوي والأنسجة الهندسية من خلال تقنيات التصنيع باستخدام الأعمدة ومجموعة متنوعة من الأشكال. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لإنتاج الأنسجة الهندسية ذات الحجم والشكل والمحاذاة التي يتم التحكم فيها. يمكن أيضا تطبيقه على نماذج الأمراض المختلفة ، والطب التجديدي الشخصي ، ولترجمة الأنسجة المهندسة إلى الدراسات قبل السريرية.

ابدأ بفتح برنامج رسومات متجهة على جهاز كمبيوتر. لإعداد هندسة القالب المطلوبة وتنسيق المتجه ، افتح لوحة قماشية جديدة ذات أبعاد مناسبة بتنسيق ألوان RGB. بعد ذلك ، حدد أداة الشكل من اللوحة اليسرى وقم بإنشاء الشكل الهندسي المطلوب عن طريق إدخال الأبعاد في الجزء العلوي من النافذة لتحديد أحجام الأشكال بدقة.

صمم هندسة القالب للسماح بحدود ستة ملليمترات على الأقل من حافة الميزات الخارجية وخط القطع للسماح بتقليم الغضروف المفصلي PDMS بعد صب القالب. سيسمح ذلك للقالب النهائي بوضع التدفق مع الجزء السفلي من طبق الثقافة. بعد ذلك ، افتح منتقي الألوان في الزاوية العلوية اليسرى من النافذة وحدد حوامل ألوان جديدة متوافقة مع برنامج القطع بالليزر.

حدد كل مسار وقم بتعيين لون مناسب له من حامل القص. عند الانتهاء، قم بتعيين لا شيء للون التعبئة. وبالمثل، قم بتعيين ألوان عينة لمسارات النقش عن طريق تحديد الكائن ثم تحديد مسار النقش للون التعبئة و None للون المسار من منتقي الألوان.

احفظ التصميمات إما بتنسيق ملفات AI or. pdf ، اعتمادا على ما هو مناسب لبرنامج الرسومات المتجهة وقاطع الليزر. قم بإعداد قاطع الليزر للقطع وفقا لمواصفات الشركة المصنعة وتأكد من استخدام تهوية كافية.

ثم ضع ورقة 1/4 بوصة من الأكريليك على سرير الليزر. اضبط ارتفاع السرير بحيث تتم معايرته بشكل صحيح مع الأكريليك. بعد ذلك ، افتح ملف التصميم على الكمبيوتر المتصل بقاطع الليزر وافتح قائمة الطباعة.

تأكد من ضبط قاطع الليزر كطابعة وتحديد عدم القياس في القائمة المنسدلة التحجيم لمنع تشويه التصميم. ثم انقر فوق طباعة زر في الجزء السفلي من مربع الحوار طباعة. في أداة طباعة القاطع بالليزر ، انقر فوق زر الإعداد لتعيين معلمات حفر القطع لكل ميزة من ميزات التصميم.

هنا ، قم بتعيين معلمات الطاقة والسرعة والنبضات لكل بوصة لكل لون من الألوان المختارة مسبقا. بمجرد إدخال الإعدادات ، انقر فوق الزر الأخضر الكبير في برنامج القطع بالليزر. سيؤدي ذلك إلى بدء قاطع الليزر في حفر وقطع القوالب الرئيسية السلبية.

أخيرا ، استخدم فرشاة صغيرة أو هواء مضغوطا لإزالة أي حطام متبقي من القوالب الرئيسية السلبية. سيؤدي ذلك إلى إعداد السطح لصب PDMS. قم بإعداد مزيج صب PDMS وفقا لمواصفات الشركة المصنعة.

قم بإزالة PDMS المحضرة في غرفة مفرغة متصلة بمختبر تفريغ الخط القياسي لمدة ساعة واحدة أو حتى يتم التخلص من جميع الفقاعات. أثناء تفريغ PDMS ، خذ الحافة الخارجية للقالب باستخدام الفينيل أو الشريط اللاصق ، بحيث يمتد الشريط بمقدار ثلاثة ملليمترات على الأقل فوق الوجه المحفور للقالب الرئيسي السلبي. تأكد من الضغط على الشريط بقوة على جانب القالب حتى تمنع التسرب لاحقا.

بعد ذلك ، صب ما يقرب من 0.35 مل لكل سنتيمتر مربع من PDMS في القالب الرئيسي بحيث يصل سمك PDMS إلى 1.5 ملليمتر كحد أدنى. ضع القالب الرئيسي السالب المطلي ب PDMS في غرفة مفرغة وقم بتفريغه مرة أخرى لمدة ساعة واحدة أو حتى يتم التخلص من جميع الفقاعات. بعد ذلك ، ضع القالب الرئيسي السلبي المطلي ب PDMS منزوع الغاز على رف مستو في فرن 60 درجة مئوية لمدة ست ساعات على الأقل لمعالجة PDMS.

بمجرد المعالجة ، استخدم شفرة حلاقة لقطع القوالب الفردية بينما لا تزال على القالب الرئيسي السلبي. بعد ذلك ، قم بتقشير كل قالب PDMS ببطء وبعناية من القالب الرئيسي السلبي. قم بقص أي مناطق بها غضروف مفصلي من الصب ، مما يمنع القالب من الاستلقاء بشكل مسطح ، وكذلك أي مواد زائدة أو حطام.

أخيرا ، قم بتعقيم القوالب باستخدام دورة الأوتوكلاف القياسية لتعقيمها لزراعة الأنسجة. للبدء ، قم بلصق القوالب على الألواح البلاستيكية غير المعالجة. قم بإعداد محاليل الفيبرينوجين والثرومبين والكولاجين المحايد وحصاد الخلايا المرغوبة كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب.

اجمع بين الفيبرينوجين والكولاجين المحايد وتعليق الخلية لإنشاء مزيج صب. احتفظ بمزيج الصب على الثلج. بعد ذلك ، استخدم مولدا عالي التردد محمولا باليد لمعالجة أسطح القالب الذي سيتعرض لمزيج الصب للتخفيف من مقاومة الماء PDMS.

قم بتعريض الأسطح للمعالجة بالبلازما لمدة ثلاث إلى خمس ثوان قبل صب المادة بحوالي خمس دقائق. مباشرة قبل صب خليط خلايا البروتين ، أضف الثرومبين إلى مزيج الصب والماصة لأعلى ولأسفل برفق دون إدخال أي فقاعات. العمل بسرعة ، قم بعمل ماصة مزيج الصب في القوالب مع العناية لإيداع المزيج في جميع زوايا وشقوق القالب.

تجنب إخراج المزيج بعد المحطة الأولى للماصة لمنع تكون الفقاعات داخل الأبنية. ثم ضع العينات في حاضنة رطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. بعد 45 دقيقة ، أعد التركيبات إلى غطاء المحرك وقم بتغطيتها بوسائط خلوية قبل العودة إلى الحاضنة.

قم بتغيير الوسائط الخلوية كل 48 إلى 72 ساعة حسب الحاجة للخلية ونوع البناء. أخيرا ، اتبع بروتوكول النص المصاحب لكمية ضغط الأنسجة وخصائص الشد للتركيبات ، وكذلك لإعداد تقنيات التلوين المختلفة وقياس محاذاة الخلايا. بمرور الوقت والثقافة ، يتم دمج التركيبات الخلوية بسبب إعادة تشكيل المصفوفة.

يحدث هذا من خلال إعادة تنظيم وتدهور المصفوفة المحيطة ويرتبط عادة بزيادة الصلابة الميكانيكية. يمكن أن يؤدي الضغط الموجه أيضا إلى إحداث مجالات الإجهاد داخل الأنسجة ، والتي يمكن التلاعب بها في التركيبات الخلوية لتشجيع محاذاة الخلايا. تم التقاط هاتين الصورتين من تركيبات أنسجة القلب التي نمت في قوالب مستطيلة بحجم ثلاثة ملليمترات × 17 ملم مع أعمدة في كلا الطرفين.

وهاتان الصورتان عبارة عن تركيبات أنسجة القلب التي نمت دون قيود. كان البنيان اللذان كانا مقيدين قادرين فقط على الضغط في الاتجاهين المتبقيين وأديا إلى محاذاة خلوية ناتجة عن الإجهاد. بمجرد إتقانها ، يمكن استخدام هذه التقنية لتصميم وتصنيع وتنفيذ قوالب المناديل المخصصة في أقل من يوم واحد.

بعد تكوين الأنسجة ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الاختبار الميكانيكي والأنسجة لفهم تأثيرات المحاذاة على مورفولوجيا الخلية ووظيفة الأنسجة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع قوالب أنسجة PDMS مخصصة من أساتذة الأكريليك المقطوعة بالليزر.