بيرفوسابل شبكة الأوعية الدموية مع نموذج أنسجة في جهاز موائع جزيئية
April 4th, 2018
البروتوكول يصف كيفية مهندس شبكة الأوعية الدموية بيرفوسابل في كروي. هو استنباط المكروية المحيطة كروي للحث على الأوعية والاتصال كروي ميكروتشانيلس في جهاز موائع جزيئية. الأسلوب يسمح نضح كروي، وأسلوب الذي طال انتظاره في الثقافات ثلاثي الأبعاد.
الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام منصة موائع دقيقة لبناء شبكة وعائية قابلة للانزعاج في مجمع متعدد الخلايا ، أو كروي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة الأسئلة الرئيسية في الشكل البديل لمجالات الطب التجديدي ، مثل مدى أهمية شبكة الأوعية الدموية في نماذج الأنسجة في الجسم الحي وفي المختبر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن محاكاة طريق إعطاء الأدوية والمكملات الغذائية في المختبر عن طريق توصيل المناطق ذات الأهمية مباشرة إلى الكرويات.
بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب صعوبة إدخال الخلايا في المنطقة المستهدفة في جهاز الموائع الدقيقة. بعد صب البوليمر المسبق PDMS ، قم بإزالة الغاز من المادة في غرفة مفرغة لمدة ساعتين ، متبوعا بالمعالجة الليلية عند 80 درجة مئوية في فرن جيد التهوية. في صباح اليوم التالي ، قم بتقشير PDMS من رقاقة السيليكون ، واستخدم ثقب ثقب قطره ملليمترين لإنشاء ثقوب في المادة في المواضع المشار إليها.
استخدم ثقب بقطر ملليمتر واحد لإنشاء البئر الكروي ، واستخدم شريطا لاصقا لتنظيف لوح PDMS وزلة غطاء زجاجي مقاس 24 × 24 ملم. عالج البلاطة النظيفة بالبلازما الهوائية لمدة 40 ثانية ، واربط لوح PDMS بقلة الغطاء. بعد ذلك ، عالج PDMS عند 80 درجة مئوية لمدة 12 ساعة على الأقل.
قبل يومين إلى ثلاثة أيام من بذر جهاز الموائع الدقيقة ، أضف ثلاثة أضعاف 10 إلى الخامس hLF المذاب حديثا ، و RFP-HUVECs ، و GFP-HUVECs إلى 10 ملليلتر من الوسط البطاني الطازج في طبق 10 ملم. عندما تصل hLFs و RFP-HUVECs إلى التقاء فرعي ، قم بتعليق hLFs و RFP-HUVECs في الوسط البطاني إلى التركيزات النهائية عند 1.0 مرة 10 إلى الخامس و 2.5 مرة 10 إلى الخلايا الرابعة لكل ملليمتر ، على التوالي. بعد يومين في ثقافة التعليق ، في خزانة السلامة الحيوية ، أضف قطرة سعة 99 ميكرولتر من محلول المزيج الرئيسي المحضر حديثا في وسط طبق بتري مقاس 35 ملم على الجليد.
لتحميل جهاز الموائع الدقيقة ، استخدم طرف ماصة دقيقة معدل سعة 100 ميكرولتر لنقل كروي و 100 ميكرولتر من الوسط إلى طبق بتري ثان بدرجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بشفط الكروي بأقل قدر من الوسط ، وقم بتدوير الماصة في وضع مستقيم بحيث يتحرك الكروي إلى أسفل طرف الماصة عن طريق الجاذبية. المس طرف الماصة على الغضروف المفصلي لقطرة المزيج الرئيسية لإخراج الكروي في المحلول دون الضغط على مكبس الماصة.
بعد ذلك ، أضف بسرعة ميكرولتر واحد من الثرومبين الطازج إلى القطرة ، واخلط الثرومبين برفق في المحلول. مع ضبط الماصة على سبعة ميكرولترات ، انقل الكروي ببطء إلى البئر الكروي لبلاطة PDMS. الخطوة الأكثر أهمية في الإجراء هي حقن الكروي بما يكفي من الجل للسماح للكروي بالاستقرار في الجزء السفلي من الجهاز.
بعد التحميل ، قم بإزالة طرف الماصة برفق لمنع التسرب بين الدعامات الدقيقة. احتضان الكروي عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. عندما يصلب الفيبرين ، قم بحقن 20 إلى 30 ميكرولترا من الوسط البطاني ببطء في الفتحات واحدة A و ثلاثة A لتحميل القناتين الأولى والثالثة ، على التوالي.
بعد ذلك ، انقل الجهاز إلى منديل مبلل في طبق 100 ملم ، واحتضان الجهاز عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة لتسهيل إزالة أي فقاعات في الواجهة بين الوسط والفيبرين. في اليوم التالي ، أضف ملليلترين من 0.05٪ تريبسين-EDTA إلى GFP-HUVECs الفرعية ، وأوقف تفاعل التربسين بأربعة ملليلتر من الوسط الكامل عندما تنفصل الخلايا تماما. اجمع الخلايا البطانية عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في وسط بطاني جديد بخمسة أضعاف 10 إلى الخلايا السادسة لكل تركيز مليلتر.
بعد ذلك ، قم بحقن 20 ميكرولترا من HUVECs في الفتحة الأولى B لتحميل القناة الأولى ، وضع الجهاز عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، مائلا بزاوية 90 درجة للتأكد من أن HUVECs تلتصق بالفيبرين في القناة الثانية. بعد تحميل القناة الثالثة بنفس الطريقة ، ضع الجهاز في طبق جديد بحجم 100 ملم يحتوي على منديل مبلل في حاضنة زراعة الخلايا لمدة سبعة إلى 14 يوما ، مع استبدال نصف الوسط في القناتين الأولى والثالثة يوميا. تظهر هذه الصور التمثيلية التي تم التقاطها في اليوم صفر من تحميل HUVEC هلام الفيبرين محملا في القناة الثانية فقط ، دون أي تسرب في القنوات الأولى أو الثالثة ومع توصيل HUVECs بنجاح بالجدار الجانبي لهلام الفيبرين.
يمكن أيضا ملاحظة أن السكوية تستقر بشكل صحيح في الجزء السفلي من الجهاز. لوحظت البراعم الوعائية بدءا من اليوم الأول ، حيث يصل أطول برعم إلى الكرة الكروية في اليوم الثالث من هذه التجربة ، ومع وصول معظم البراعم المسببة للأوعية الدموية إلى الكروية بحلول اليوم السابع. على النحو الأمثل ، بعد أربعة أيام في الجهاز ، يمكن ملاحظة التدفق من خلال تجويف الأوعية الدموية مع تحديد زاوية الأوعية الدموية على أنها اتجاه طرف الأوعية الدموية ومركز الكروية من جذر الأوعية الدموية.
تنخفض زوايا الأوعية الدموية بطريقة تعتمد على الوقت مما يشير إلى هجرة البراعم الوعائية نحو الكروية. يمكن أن تشكل RFP و GFP-HUVECs بشكل منسق تجويف وعائي واحد ، مما يشير بوضوح إلى كيفية ظهور براعم الأوعية الدموية من القنوات الأولى والثالثة إلى مفاغرة RFP-HUVECs في الكروية لتشكيل شبكة وعائية مستمرة. علاوة على ذلك ، يتدفق FITC-dextern المحقون في القناة الأولى إلى شبكة الأوعية الدموية المبنية وداخل الكروية ، ويصل في النهاية إلى القناة الثالثة ، مما يعني أن شبكة الأوعية الدموية المتكاملة يمكن أن توفر العناصر الغذائية وتزيل النفايات من الكروية.
بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في المجال الكهربائي العضوي لاستكشاف فعالية الأدوية أو المكملات الغذائية ذات الأهمية في نماذج الأنسجة المختبرية.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول هندسة شبكة وعائية قابلة للنفاذ داخل سبيرويد باستخدام منصة ميكروفلويدية. تسهل الطريقة محاكاة توصيل الدواء مباشرة إلى السبيرويدات، وتعالج أسئلة مهمة في نمذجة الأنسجة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الميكروفلويدية
- بيولوجيا الأوعية الدموية
- هندسة الأنسجة
الخلفية
- فهم الشبكات الوعائية أمر بالغ الأهمية للنماذج النسيجية في المختبر وفي الجسم الحي.
- كانت عملية التروية في الثقافات ثلاثية الأبعاد تقنية طال انتظارها.
- تعزز الطريقة دراسة مسارات إعطاء الدواء والمكملات الغذائية.
- توجد تحديات في إدخال الخلايا إلى الأجهزة الميكروفلويدية.
غرض الدراسة
- لبناء شبكة وعائية قابلة للنفاذ في تجميعات متعددة الخلايا.
- للمحاكاة في المختبر لتوصيل الدواء.
- لتحسين فهم الشبكات الوعائية في الطب التجديدي.
الطرق المستخدمة
- استخدام منصة ميكروفلويدية لبناء الشبكة.
- صب ومعالج PDMS ما قبل البوليمر.
- إزالة الغاز في غرفة تفريغ.
- إنشاء فتحات في PDMS لإدخال الخلايا.
النتائج الرئيسية
- نجحت الطريقة في إنشاء شبكة وعائية قابلة للنفاذ.
- يمكن محاكاة توصيل الدواء بشكل فعال في السبيرويدات.
- تم تحديد التحديات في إدخال الخلايا ومعالجة هذه التحديات.
- تعزز هذه التقنية أهمية النماذج المختبرية.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول أداة قيمة لدراسة الشبكات الوعائية.
- يفتح آفاقًا جديدة للبحث في الطب التجديدي.
- قد تؤدي التحسينات الإضافية إلى تحسين تقنيات إدخال الخلايا.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Integrating a perfusable vascular network within spheroid tissue models addresses a critical barrier in recapitulating in vivo-like nutrient and waste exchange for drug discovery and tissue engineering. This microfluidic approach enables simulation of physiological perfusion, supporting predictive confidence in compound delivery and tissue response studies. The platform enhances translational relevance for early-stage screening and mechanistic de-risking in regenerative medicine and biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of vascularization's role in tissue function and drug response.
- Supports mechanistic de-risking by modeling nutrient and waste exchange in 3D systems.
- Improves predictive confidence for target validation in complex tissue environments.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of physiologically relevant, perfusable spheroid models for compound evaluation.
- Enables quantitative assessment of drug delivery and distribution within tissue constructs.
- Supports reproducible assay development by standardizing vascular integration in microfluidic devices.
Translational & Preclinical Research
- Provides a platform for disease-relevant modeling of vascularized tissues in vitro.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation by mimicking in vivo perfusion.
- Reduces translational risk by aligning in vitro models with physiological tissue architecture.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic vascularization method fits from early discovery through lead identification and preclinical validation, supporting hypothesis testing and translational continuity.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing on vascular function and tissue viability in engineered models.
- Screening: Delivers assay-ready, perfusable spheroids for robust compound screening.
- Analytics: Provides quantitative perfusion and distribution readouts for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro and in vivo studies by replicating physiological perfusion.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microfluidic platform adaptable to diverse tissue and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in tissue-based assays.
- Operational Value: Standardizes vascularized tissue model preparation for scalable workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing physiologically relevant data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on more predictive in vitro models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, cell culture, and tissue engineering.
- Needs access to microfabrication tools and imaging infrastructure for monitoring perfusion.
- Demands cross-team standardization for reproducibility in device preparation and cell loading.
- Adaptable to various cell types and tissue models with protocol optimization.
- Critical steps include precise cell introduction and gel handling to prevent leakage and ensure network integrity.
![تطوير وتوصيف في المختبر شبكة Microvessel والقياسات الكمية من غشائي [كا 2+] ط والنيتريك إنتاج أكسيد](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F54014.jpg%3Fv%3D2026-07-07T20%253A58%253A27.244Z&w=384&q=75)
