بيرفوسابل شبكة الأوعية الدموية مع نموذج أنسجة في جهاز موائع جزيئية

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام منصة موائع دقيقة لبناء شبكة وعائية قابلة للانزعاج في مجمع متعدد الخلايا ، أو كروي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة الأسئلة الرئيسية في الشكل البديل لمجالات الطب التجديدي ، مثل مدى أهمية شبكة الأوعية الدموية في نماذج الأنسجة في الجسم الحي وفي المختبر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن محاكاة طريق إعطاء الأدوية والمكملات الغذائية في المختبر عن طريق توصيل المناطق ذات الأهمية مباشرة إلى الكرويات.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب صعوبة إدخال الخلايا في المنطقة المستهدفة في جهاز الموائع الدقيقة. بعد صب البوليمر المسبق PDMS ، قم بإزالة الغاز من المادة في غرفة مفرغة لمدة ساعتين ، متبوعا بالمعالجة الليلية عند 80 درجة مئوية في فرن جيد التهوية. في صباح اليوم التالي ، قم بتقشير PDMS من رقاقة السيليكون ، واستخدم ثقب ثقب قطره ملليمترين لإنشاء ثقوب في المادة في المواضع المشار إليها.

استخدم ثقب بقطر ملليمتر واحد لإنشاء البئر الكروي ، واستخدم شريطا لاصقا لتنظيف لوح PDMS وزلة غطاء زجاجي مقاس 24 × 24 ملم. عالج البلاطة النظيفة بالبلازما الهوائية لمدة 40 ثانية ، واربط لوح PDMS بقلة الغطاء. بعد ذلك ، عالج PDMS عند 80 درجة مئوية لمدة 12 ساعة على الأقل.

قبل يومين إلى ثلاثة أيام من بذر جهاز الموائع الدقيقة ، أضف ثلاثة أضعاف 10 إلى الخامس hLF المذاب حديثا ، و RFP-HUVECs ، و GFP-HUVECs إلى 10 ملليلتر من الوسط البطاني الطازج في طبق 10 ملم. عندما تصل hLFs و RFP-HUVECs إلى التقاء فرعي ، قم بتعليق hLFs و RFP-HUVECs في الوسط البطاني إلى التركيزات النهائية عند 1.0 مرة 10 إلى الخامس و 2.5 مرة 10 إلى الخلايا الرابعة لكل ملليمتر ، على التوالي. بعد يومين في ثقافة التعليق ، في خزانة السلامة الحيوية ، أضف قطرة سعة 99 ميكرولتر من محلول المزيج الرئيسي المحضر حديثا في وسط طبق بتري مقاس 35 ملم على الجليد.

لتحميل جهاز الموائع الدقيقة ، استخدم طرف ماصة دقيقة معدل سعة 100 ميكرولتر لنقل كروي و 100 ميكرولتر من الوسط إلى طبق بتري ثان بدرجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بشفط الكروي بأقل قدر من الوسط ، وقم بتدوير الماصة في وضع مستقيم بحيث يتحرك الكروي إلى أسفل طرف الماصة عن طريق الجاذبية. المس طرف الماصة على الغضروف المفصلي لقطرة المزيج الرئيسية لإخراج الكروي في المحلول دون الضغط على مكبس الماصة.

بعد ذلك ، أضف بسرعة ميكرولتر واحد من الثرومبين الطازج إلى القطرة ، واخلط الثرومبين برفق في المحلول. مع ضبط الماصة على سبعة ميكرولترات ، انقل الكروي ببطء إلى البئر الكروي لبلاطة PDMS. الخطوة الأكثر أهمية في الإجراء هي حقن الكروي بما يكفي من الجل للسماح للكروي بالاستقرار في الجزء السفلي من الجهاز.

بعد التحميل ، قم بإزالة طرف الماصة برفق لمنع التسرب بين الدعامات الدقيقة. احتضان الكروي عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. عندما يصلب الفيبرين ، قم بحقن 20 إلى 30 ميكرولترا من الوسط البطاني ببطء في الفتحات واحدة A و ثلاثة A لتحميل القناتين الأولى والثالثة ، على التوالي.

بعد ذلك ، انقل الجهاز إلى منديل مبلل في طبق 100 ملم ، واحتضان الجهاز عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة لتسهيل إزالة أي فقاعات في الواجهة بين الوسط والفيبرين. في اليوم التالي ، أضف ملليلترين من 0.05٪ تريبسين-EDTA إلى GFP-HUVECs الفرعية ، وأوقف تفاعل التربسين بأربعة ملليلتر من الوسط الكامل عندما تنفصل الخلايا تماما. اجمع الخلايا البطانية عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في وسط بطاني جديد بخمسة أضعاف 10 إلى الخلايا السادسة لكل تركيز مليلتر.

بعد ذلك ، قم بحقن 20 ميكرولترا من HUVECs في الفتحة الأولى B لتحميل القناة الأولى ، وضع الجهاز عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، مائلا بزاوية 90 درجة للتأكد من أن HUVECs تلتصق بالفيبرين في القناة الثانية. بعد تحميل القناة الثالثة بنفس الطريقة ، ضع الجهاز في طبق جديد بحجم 100 ملم يحتوي على منديل مبلل في حاضنة زراعة الخلايا لمدة سبعة إلى 14 يوما ، مع استبدال نصف الوسط في القناتين الأولى والثالثة يوميا. تظهر هذه الصور التمثيلية التي تم التقاطها في اليوم صفر من تحميل HUVEC هلام الفيبرين محملا في القناة الثانية فقط ، دون أي تسرب في القنوات الأولى أو الثالثة ومع توصيل HUVECs بنجاح بالجدار الجانبي لهلام الفيبرين.

يمكن أيضا ملاحظة أن السكوية تستقر بشكل صحيح في الجزء السفلي من الجهاز. لوحظت البراعم الوعائية بدءا من اليوم الأول ، حيث يصل أطول برعم إلى الكرة الكروية في اليوم الثالث من هذه التجربة ، ومع وصول معظم البراعم المسببة للأوعية الدموية إلى الكروية بحلول اليوم السابع. على النحو الأمثل ، بعد أربعة أيام في الجهاز ، يمكن ملاحظة التدفق من خلال تجويف الأوعية الدموية مع تحديد زاوية الأوعية الدموية على أنها اتجاه طرف الأوعية الدموية ومركز الكروية من جذر الأوعية الدموية.

تنخفض زوايا الأوعية الدموية بطريقة تعتمد على الوقت مما يشير إلى هجرة البراعم الوعائية نحو الكروية. يمكن أن تشكل RFP و GFP-HUVECs بشكل منسق تجويف وعائي واحد ، مما يشير بوضوح إلى كيفية ظهور براعم الأوعية الدموية من القنوات الأولى والثالثة إلى مفاغرة RFP-HUVECs في الكروية لتشكيل شبكة وعائية مستمرة. علاوة على ذلك ، يتدفق FITC-dextern المحقون في القناة الأولى إلى شبكة الأوعية الدموية المبنية وداخل الكروية ، ويصل في النهاية إلى القناة الثالثة ، مما يعني أن شبكة الأوعية الدموية المتكاملة يمكن أن توفر العناصر الغذائية وتزيل النفايات من الكروية.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في المجال الكهربائي العضوي لاستكشاف فعالية الأدوية أو المكملات الغذائية ذات الأهمية في نماذج الأنسجة المختبرية.