عزل وتوصيف الخلايا اللحمية الوسيطة القلب من عينات مرضى اعتلال عضلة القلب أرهيثموجينيك بيوبتيك اندوميوكارديال

تتمثل الأهداف العامة لهذا البروتوكول في عزل الخلايا اللحمية الوسيطة القلبية عن مرضى اعتلال عضلة القلب بعدم انتظام ضربات القلب ، واختبار كفاءتهم في التمايز الشاهم والنمط الظاهري لعلاماتهم السطحية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال اعتلال عضلة القلب غير المنتظم ، مثل تورط الخلايا اللحمية القلبية في استبدال adipo والتأكيد على الآليات الجزيئية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إجراء عزل خلايا الفغرة بعدد قليل من الممرات البسيطة من عينات القلب الصغيرة جدا.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لدراسة اعتلال عضلة القلب غير المنتظم. يمكن تطبيقه أيضا على أنظمة أخرى مثل دراسة أمراض القلب والأوعية الدموية التي يشار إليها بخزعة بطانة القلب. درسنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما فهمنا أنه يمكننا تقليص إجراء عزل خلايا الفغرة لتطبيقه على خزعات القلب والفيزيولوجيا الكهربية التي يمكن أن توفرها لنا.

بالنسبة لهذا البروتوكول ، قم بجمع خزعة بطانة القلب من البطين الأيمن لمريض ACM باستخدام رسم الخرائط التشريحية الكهربائي المتكامل والتنظير الفلوري للقلب. خذ حوالي خمسة جرامات من الأنسجة وشحنها إلى المختبر في وسط TMES. في المختبر ، قم بإعداد خزانة السلامة البيولوجية حسب الحاجة لتنفيذ الإجراء حتى الهضم الداخلي.

ثم انقل الخزعة إلى طبق واغسلها مرتين باستخدام PBS. في هذه المرحلة ، قد يتم توثيق الخزعة بالصورة تحت المجهر. بعد ذلك ، انقل الخزعة إلى أنبوب سعة ملليلترين يحتوي على مليلتر واحد من محلول الكولاجيناز.

في ذلك ، قم بتقطيع العينة إلى أجزاء صغيرة ، يتراوح عرضها بين 0.5 ملليمتر واحد. ثم احتضان الأنسجة لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع تحريض دوار مستمر. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للمحلول المهضوم ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من PBS.

ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب مرة أخرى ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من TMES. الآن قم بوضع التعليق على لوحة 60 ملم واملأ اللوحة حتى ثلاثة ملليلتر باستخدام TMES ، ولكن ليس أكثر. ثم استزراع الخلايا وتوسيعها وفقا لبروتوكول النص.

قبل البدء ، احصل على كاشف تفكك الخلية ، ومخزن الغسيل ، والأجسام المضادة المطلوبة جاهزة للاستخدام. عندما يصل عدد الخلايا المقدر للثقافة إلى ثلاثة ملايين ، اغسل اللوحة 100 ملم مرتين باستخدام 10 مل من PBS المعقم. بعد ذلك ، أضف خمسة ملليلتر من كاشف تفكك الخلية إلى الخلايا واحتضن اللوحة لمدة سبع إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لفصل الخلايا.

بمجرد فصل الخلايا ، أضف 15 مل من PBS إلى الخلايا وانقل المعلق إلى أنبوب سعة 50 مل. الآن ، قم بالطرد المركزي للخلايا وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من محلول الغسيل. ثم عد الخلايا وانقل ثلاثة ملايين إلى أنبوب جديد بحجم نهائي يبلغ 1.5 مل من محلول الغسيل.

بعد ذلك ، قم بتقسيم التعليق إلى 12 أنبوب فاكس. في كل أنبوب ، أضف الأجسام المضادة المستخدمة لتوصيف CMSCs بالتركيزات الموصى بها. تأكد من تضمين عناصر تحكم النمط المتماثل.

بمجرد التحضير ، احتضن الأنابيب لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء. أضف لاحقا ملليلترا واحدا من محلول الغسيل إلى كل أنبوب لإيقاف التفاعلات. ثم قم بالطرد المركزي للخلايا ، وإزالة المادة الطافية ، وإعادة تعليق الكريات في 250 ميكرولتر من محلول الغسيل.

انتقل الآن إلى توصيف الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي. بعد التمايز الشادي للخلايا ، استخدم تلطيخ ORO لاختبار تراكم الدهون. قبل البدء ، تأكد من وجود حل عمل ORO.

قبل تلطيخ الخلايا ، قم بإزالة الوسط وغسل الخلايا مرتين باستخدام ملليلترين من PBS. ثم قم بتغطية الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهايد واتركها ثابتة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، تخلص من بارافورمالدهيد واغسل الخلايا مرتين باستخدام ملليلترين من PBS.

بعد الغسيل الثاني ، أضف ما يكفي من محلول عمل ORO لتغطية الخلايا. ثم احتضان الطبق لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. يجب إجراء هذه الحضانة في بيئة لا يعمل فيها الحل التلقائي ، لذلك لا ينصح بغرف كاملة.

بعد الحضانة ، قم بشفط محلول ORO واغسل الخلايا بملليلترين من PBS عدة مرات حتى لا يمكن رؤية البقعة في غسل PBS وحتى ، عند النظر إليها تحت المجهر ، لا يتم اكتشاف تلطيخ غير محدد. الآن ، باستخدام مجهر تباين طور زراعة الأنسجة المقلوب ، التقط 20 صورة لكل بئر بتكبير 20 ضعفا. وترد التفاصيل في بروتوكول النص.

تم عزل CMSCs من خزعات بطانة القلب كما هو موصوف. لتأكيد نسبهم الوسيط ، تم تحضين الخلايا بالأجسام المضادة المترافقة المناسبة وتحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي. كانت CMSCs إيجابية للمستضدات السطحية الوسيطة المحددة CD29 و CD44 و CD105.

المعروف أن جزء الخلايا الموجبة CD90 متغير. لم يتم التعبير عن علامات التراث البطاني ، وتراث الخلايا الأحادية أو البلاعم ، والتراث الصوتي ، والمركب الرئيسي للتوافق النسيجي. بعد ذلك ، تم استزراع CMSCs في وسط T.ADIPO للتمايز الدهني وتلطيخها ب ORO للبحث عن قطرات الدهون داخل الخلايا.

تراكمت CMSCs من المرضى الذين يعانون من اعتلال عضلة القلب غير المنتظم المزيد من قطرات الدهون ثم الخلايا من الضوابط الصحية. تم قياس هذه الفروق في ظل ظروف التمايز في 72 ساعة وسبعة أيام. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء دقة الخلية في ثلاث ساعات ، ويمكن إجراء التلوين في ساعتين ، ويمكن إكمال تحليل الفاكس في ثلاث ساعات.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل اختبار المخدرات من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل هل يمكننا استخدام خلايا الفغرة من نفس المرضى للاستجابة لمحفزات مختلفة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال اعتلال عضلة القلب غير المنتظم لاستكشاف مشاركة خلايا سدى القلب البشري في التسبب في المرض.