جراحة ستيريوتاكسيك للتلاعب بالجينات في خلايا أدمغة الفأر الولدان سترياتال

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في التطور الجيني والعصبي مثل أثناء تطور ما بعد الولادة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تقنية بسيطة مع جهاز محلي الصنع. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن إجراء الحقن المستهدفة في الدماغ يتطلب اهتماما كاملا بالتفاصيل.

للبدء ، اجعل حاملا يستخدم الجراء حديثي الولادة في جهاز تجسيم. اصنع صينية الرأس أولا. اقطع حوالي 1/5 من قاع أنبوب الطرد المركزي سعة 1.5 مل لعمل فتحة لرأس جرو حديثي الولادة.

بعد ذلك، حدد صندوق طرف ماصة فارغ يناسب قاعدة الجهاز التجسيمي. ثم استخدم الغراء الساخن لتثبيت صينية الرأس بقاعدة صندوق الأطراف. بعد ذلك ، قم بلصق شريط تضمين المناديل على الصندوق حيث يمكنه دعم جذع الجرو أثناء تثبيت رأسه.

الآن قم بإعداد 30 إبر من الفولاذ المقاوم للصدأ للحقن. أولا ، قم بتنظيفها مسبقا عن طريق نقعها في الكلوروفورم لمدة ثلاثة أيام في قارورة زجاجية. بعد ثلاثة أيام ، قم بإزالة الإبر بعناية واغسلها بالإيثانول المطلق لمدة 20 دقيقة وب 50 دورة في الدقيقة من التحريض.

ثم اغسلها ثلاث مرات في 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق لكل غسلة أيضا مع التحريض. بعد الغسيل ، اترك الإبر تجف في الهواء واحفظها في صندوق نظيف في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام. بالنسبة لتجميع الحقن المجهري ، استخدم قطعة بطول خمسة سنتيمترات من أنابيب البولي إيثيلين PE20 لربط أنبوب PE10 بحقنة قياس 26 10 ميكرولتر.

قم بتأمين التقاطع باستخدام cyanoacrylate. بعد ذلك ، قم بتركيب إبرة الحقن الجديدة قياس 30 على الطرف الآخر من أنبوب PE10. الآن قم بتحميل حقنة الحقن المجهري سعة 10 ميكرولتر.

قم بإزالة المكبس واستخدم حقنة أخرى قياس 25 لتحميل المجموعة بالماء المقطر المعقم لإزالة الهواء من الأنبوب. ثم ضع المكبس مرة أخرى إلى حقنة الميكرولتر وادفع المكبس حتى يبقى ميكرولتر فقط من الماء المقطر في البرميل وليس أقل. بعد ذلك ، قم بتركيب حقنة الميكرولتر بعناية على مضخة حقنة microflow.

ثم ماصة كميات صغيرة من الصبغة الخضراء السريعة المفلترة بنسبة 0.1٪ في سوائل الفيروس التجريبية على قطعة من البارافيلم الآن استنشق كمية صغيرة من الهواء في المحقنة حتى تظهر فقاعة هواء بين إبرة الحقن والأنبوب. ثم قم بتحميل 0.7 ميكرولتر من محلول Fast Green المصفى لاختبار تدفق السوائل في أنبوب الحقن المجهر.

إذا كان التدفق جيدا ، فقم بشفط كمية صغيرة أخرى من الهواء لعمل فقاعة هواء ثانية واتبعها تحميل محلول الحقن في أنبوب الحقن المجهر. قم بتوصيل إبرة الحقن المجهري وتثبيتها بالجهاز التجسيمي والمضي قدما في الحقن المجهري للفئران حديثي الولادة. استعدادا للجراحة ، امسح الأداة التجسيمية جيدا بنسبة 70٪ من الإيثانول وقم بتعقيم الأدوات الجراحية بنسبة 70٪ من الإيثانول.

ثم تخدير حديث الولادة باستخدام انخفاض حرارة الجسم. ضع الجرو في قفاز من اللاتكس واغمره في الثلج المجروش حتى رقبته لمدة خمس دقائق. ثم اضغط على أقدام الجرو بالملقط للتأكد من عدم وجود رد فعل دواسة.

بعد ذلك ، ضع الجرو مع القفاز في صينية الرأس وضع بعض الثلج المجروش حول غلاف اللاتكس للحفاظ على تخدير انخفاض حرارة الجسم. ثم افرك رأس الجرو بنسبة 70٪ من الإيثانول وحدد موقع معلم لامدا. ضع علامة عليها بعلامة.

ثم صوب طرف الإبرة إلى لامدا واضبط الإحداثيات الأمامية / الخلفية والوسطى / الجانبية على الصفر. بعد ذلك ، استشارة أطلس الدماغ ، انقل ذراع الحقن إلى الموقع المستهدف. على سبيل المثال ، يقع مخطط صغار P2 على بعد 2.4 ملم من لامدا ، و 1.0 ملم على جانبي خط الوسط ، و 1.7 ملم بطني.

بعد ذلك ، حدد موضع الصبغة الخضراء السريعة على أنبوب PE10 باستخدام قلم. ثم ابدأ ببطء في اختراق الإبرة من خلال الجلد والجمجمة حتى يلامس طرف الإبرة سطح الجمجمة. اضبط الإحداثيات الظهرية / البطنية على صفر.

ثم اخفض الإبرة ببطء إلى الموقع المستهدف. بمجرد الوصول إلى موضعه ، انتظر لمدة دقيقة واحدة للسماح للحمة بالعودة إلى شكلها الطبيعي. ثم قم بتشغيل برنامج الحقن المجهري بمعدل 100 نانولتر في الدقيقة.

أثناء الحقن ، شاهد صبغة Fast Green تتحرك في أنبوب PE. من الأهمية بمكان اختراق الإبرة ببطء عبر الجلد والجمجمة حتى يلامس طرف الإبرة سطح الجمجمة. أثناء الحقن ، من الضروري مشاهدة صبغة Fast Green تتحرك في أنبوب PE.

بعد اكتمال الحقن ، انتظر دقيقة واحدة ثم ارفع الإبرة ببطء إلى 1/2 من عمق DV المخترق. ثم انتظر 30 ثانية أخرى قبل الشروع في السحب البطيء للإبرة من رأس الجرو. بعد الانتهاء من الحقن ، من المهم الانتظار دقيقة واحدة قبل رفع الإبرة ببطء إلى 1/2 من عمق DV المخترق.

ثم انتظر 30 ثانية أخرى قبل سحب الإبرة ببطء من رأس الجرو. بعد حقن جميع المواقع المستهدفة ، قم بتسخين الجرو لمدة 20 دقيقة في حاضنة 33 درجة مئوية. تحقق من الجرو كل خمس دقائق حتى يستعيد الاستلقاء القصي.

ثم أعد الجرو إلى سده. تم حقن 200 نانو لتر من الفيروس الذي يعبر عن Cre DNA recombinase المدمجة مع GFP في المخطط P2 للفئران Ai14. عبرت هذه الفئران عن جين tdTomato reporter عند الحذف بوساطة Cre لشريط توقف محاط ب loxP.

تم حصاد الأدمغة في P14 للتلوين المناعي ل GFP و tdTomato. كانت العديد من الخلايا الإيجابية ل GFP المنقولة AAV موجودة في جميع أنحاء المخطط مما يشير إلى عدوى واسعة النطاق للخلايا المخططة بواسطة فيروسات AAV EGFP Cre. تم العثور على تعبير واسع النطاق مماثل عن tdTomato أيضا في المخطط.

عند الفحص المجهري عند التكبير العالي ، من الواضح أنه تم العثور على جميع الخلايا المخططة الإيجابية ل GFP تشارك في التعبير عن جين tdTomato reporter. علاوة على ذلك ، tdتم اكتشاف إشارات الطماطم في أطراف محورية مفترضة في الكرة الشاحبة ، في المادة السوداء بارس شبكية ، المناطق المستهدفة من الخلايا العصبية الإسقاط المخططة والمخططة. تشير هذه النتائج معا إلى إعادة تركيب الحمض النووي بوساطة Cre loxP ناجحة ناتجة عن التعبير بوساطة AAV لنشاط Cre في الخلايا العصبية المخططة لحديثي الولادة.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في 30 دقيقة للحقن المخطط الثنائي إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن هذه جراحة دقيقة في دماغ حديثي الولادة تتطلب الصبر والحذر. من هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل علم البصريات الوراثي وعلم الكيمياء الوراثي من أجل تحليل نضج أثناء تطور ما بعد الولادة.