العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

ويصف هذا البلاغ موريني نماذج لأغراض تجريبية ومنهجيات للعزلة وثقافة البلاعم السنخية من البشر.

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل البلاعم السنخية البشرية والفئران من الرئتين والسائل الغسيل القصبي السنخي وتطوير طريقة لثقافتها في المختبر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على بعض الأسئلة الرئيسية في مجال مناعة الرئة ، مثل دور البلاعم السنخية في عدوى الجهاز التنفسي والالتهابات والمناعة الذاتية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على تمييز البلاعم السنخية عن كريات البيض الرئوية الأخرى والحصول على مجموعة من البلاعم السنخية عالية النقاء للأغراض التجريبية.

ضع فأرة مخدرة على سطح تشريح بحيث يكون الجانب البطني متجها لأعلى. ضع مرهما بيطري للعيون على العينين لمنع الجفاف. امسح السطح البطني للفأر بالكامل بضمادات تحضير كحولية معقمة ، مشبعة بنسبة 70٪ من الأيزوبروبانول ، للتطهير.

قم بتركيب الماوس مع الاحتفاظ بجميع الأرجل الأربع. افتح تجويف البطن برفق باستخدام أدوات التشريح الدقيقة. يجب توخي الحذر لفتح أكبر قدر ممكن من المساحة دون الإضرار بأي أعضاء حشوية أو تكوين أنسجة متدلية.

افتح التجويف الصدري برفق عن طريق شق القفص الصدري ببطء عبر المنصف من الناحية المثالية ، يمكن استئصال القفص الصدري من جانب إلى آخر. يجب توخي الحذر الشديد حتى لا تؤذي غشاء الجنب في الرئتين أثناء فتح التجويف الصدري.

حدد موقع الوريد الأجوف السفلي وقم بعمل شق لنزيف الفأر. استخدم ضمادات قطنية ماصة لامتصاص الدم. حقن 10 ملليلتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج في البطين الأيمن لطرد خلايا الدم المنتشرة.

امتصاص تدفق الدم باستخدام ضمادات قطنية ماصة. بمجرد أن تتدفق تماما ، ستظهر الرئتان مبيضتين ثم تكون جاهزة للغسل. افتح الجلد والعضلات في الرقبة برفق لكشف مجرى الهواء.

استئصال العضلات والغضاريف والأنسجة الدهنية المجاورة بعناية ، دون الإضرار بالقصبة الهوائية. بعد ذلك ، قم بعمل شق صغير في القصبة الهوائية ، خلف الحنجرة. يجب أن يكون هذا الشق كافيا لإدخال قسطرة بينما لا تزال القصبة الهوائية متصلة بالحنجرة.

تتمثل الخطوة الوحيدة الأكثر أهمية في جمع سائل BAL في توصيل قسطرة بإحكام بالقصبة الهوائية لتقليل التسرب أثناء الغسيل. أدخل قسطرة قياس 22 بوصة واحدة بدون إبرة في القصبة الهوائية باتجاه الرئتين. قم بتأمين القسطرة بخياطة مضفرة من الحرير وعقدة مربعة.

وجود أيدي قوية واتباع هذه الخطوة ، يمنع ببطء وبلطف تمزق القصبة الهوائية والرئتين. قم بتوصيل حقنة سعة مليلتر واحد ، مملوءة بمحلول BAL المثلج البارد بالقسطرة وغرس المخزن المؤقت ببطء في الرئتين. سيؤدي ذلك إلى تضخيم الرئتين.

احتفظ بالمحقنة متصلة بالقسطرة لمدة خمس ثوان، ثم استنشق سائل الغسيل عن طريق سحب المكبس برفق. سيؤدي ذلك إلى تفريغ الرئتين. اجمع السائل في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر ، يوضع على الثلج.

كرر التضخم والانكماش تسع مرات أخرى ، وقم بتجميع سائل الغسيل. لا تتجاوز ملليلتر واحد من المخزن المؤقت لكل تدفق ، لأن ذلك قد يتجاوز سعة الرئة ويؤدي إلى تمزقها. جهاز الطرد المركزي 10 مل من سائل BAL عند 250 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

تحتوي حبيبات الخلية على خلايا BAL. أعد تعليق خلايا BAL في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز التدفق. تابع تلطيخ الخلايا وفرزها كما هو موضح في بروتوكول النص.

قم بإعداد فأر مخدر للتشريح ، وقم بإجراء شقوق ونزيف الماوس كما كان من قبل. حقن 10 ملليلتر من PBS المثلج في البطين الأيمن لطرد خلايا الدم المنتشرة. بمجرد أن تتدفق تماما ، ستظهر الرئتان مبيضتين وجاهزتين للحصاد.

قم بتشريح الرئتين عن طريق قطع القصبة الهوائية والأوعية الدموية والأربطة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر ، مع خمسة ملليلتر من DMEM البارد. احتفظ به على الجليد حتى الخطوة التالية. انقل الرئتين المنفوختين إلى طبق استزراع معقم وخالي من البيروجين 60 ملم مع ثلاثة ملليلتر من DMEM.

بمساعدة ملقط التشريح ، قم بإخراج الشعب الهوائية وغيرها من مواد الأنسجة الصلبة غير الرئوية ، إن وجدت. افرم أنسجة الرئة بمشرط إلى أقل من ملليمتر واحد. أضف 300 ميكروغرام لكل مليلتر من Liberase TL ، وخمس وحدات لكل مليلتر من DNAse واحد.

تخلط عن طريق سحب العينات وتحتضن على حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة لمدة 25 دقيقة. بعد 10 دقائق ، اخلطي برفق مرة واحدة عن طريق سحب العينات. مرر الرئتين المنفصلتين عبر مصفاة خلية 100 ميكرون مثبتة على أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

استخدم الجزء الخلفي من المكبس من حقنة سعة مليلتر واحد لهرس كتل الخلايا على الفلتر. اغسل الفلتر ب 20 مل من محلول الغسيل. جهاز طرد مركزي عند 500 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.

تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 20 مل من محلول الغسيل. كرر خطوات الإجهاد والطرد المركزي مرتين ، مع تغيير الفلتر والأنبوب في كل مرة. أخيرا ، قم بإعداد تعليق الخلية المفردة عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز التدفق إلى حبيبات الخلية.

قم بإجراء تلطيخ الأجسام المضادة وفرز الخلايا ، كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد فرز الخلايا ، قم بحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 250 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. أعد تعليق AMs الماوس في مليلتر واحد من وسط ثقافة AM للفأر.

بناء على المحصول والضرورة التجريبية ، قم بزرع الخلايا في شرائح الغرفة أو أطباق الثقافة أو قوارير الاستزراع. من الناحية المثالية ، قم بزرع AMs بمعدل 100،000 لكل مليلتر مع 10 ملليلتر من الوسط في قارورة زراعة الأنسجة T 25. احتضان الخلايا في حاضنة رطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪.

في غضون 24 ساعة من البذر ، يجب أن تكون AMs ملتزمة ولن يتم فصلها عن طريق تغيير لطيف في وسط الاستزراع. قم بإزالة الوسط عن طريق الشفط من أحد طرفيه ، وقم بتجديده بوسط طازج دافئ مسبقا إلى 37 درجة مئوية. أخيرا ، راقب القارورة تحت المجهر المقلوب.

يظهر تقييم قياس التدفق الخلوي للبلاعم السنخية في سائل الغسيل السنخي للفأر. تم تحديد البلاعم السنخية إيجابية لكونها إيجابية CD45 ، و CD11c إيجابية ، و Siglec-F إيجابية. كما هو موضح هنا ، هو نتيجة تمثيلية للبلاعم السنخية للفأر التي تم زراعتها في المختبر لمدة 24 ساعة.

أصبحت الخلايا ملتصقة ولن يؤدي التغيير اللطيف في وسط الثقافة إلى فصلها. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ساعتين تقريبا ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التمييز بين الفأر والبلاعم السنخية البشرية عن خلايا الرئة الأخرى.

أيضا ، كإجراءات للحصول على مجموعة جميلة من البلاعم السنخية للتجارب النهائية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه ليست كل الضامة أو الخلايا البلعمية المقيمة في الرئة هي ضامة سنخية. البلاعم السنخية هي نوع من الخلايا المتخصصة الموجودة في الرئتين منذ الولادة.

لعزل البلاعم السنخية ، يجب أن يكون التركيز على طرق الاستخراج القابلة للتطبيق من البيئة الدقيقة السنخية. تدعم طريقة الاستزراع في المختبر التي تم تطويرها هنا نمو البلاعم السنخية في حالة معملية يمكن استخدامها في المقايسات الجزيئية والخلوية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل نقل الخلايا بالتبني وعرض المستضد وتقييم الاستجابة للمنبهات الالتهابية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول بيولوجيا البلاعم السنخية.