Name: العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: تعلم عزل وزراعة البلاعم السنخية من الفئران والبشر في المختبر. توفر هذه الطريقة خلايا نقية عالية لدراسة المناعة الرئوية والأمراض التنفسية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونحن نشكر برندرغاست كلير للمساعدة في تحرير المخطوطة. دكن معتمد ببحث منح (#2095) من مؤسسة فلين ومعتمد TM من المنح المقدمة من "المعاهد الوطنية للصحة" (R01HL056643 و R01HL092514). دكن تطوير الأساليب وتصميم الدراسة وكتبت المخطوطة؛ أم ساعدت الدراسات الحيوانية وعينه سريرية المشتريات؛ SB ساعد تدفق سيتوميتريك تحليل وفرز الخلايا؛ TM الإشراف على الدراسات واستعرض المخطوطة.

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) والمؤسسية استعراض المجلس (مجلس الهجرة واللاجئين) في مستشفى القديس يوسف والمركز الطبي.
1-عزل هيئة علماء المسلمين من السوائل مورين للفيسيولوجيا الغسل (بال)
<ol><li>تخدير ماوس C57BL/6 عمرها 8 أسبوع مع الكيتامين (87.5 مغ/كغ من وزن الجسم) وإكسيلازيني (12.5 مغ/كغ من وزن الجسم) كوكتيل عبر حقن داخل. المتابعة عند بلوغ الماوس التخدير الجراحي مع فقدان ردود الفعل واسترخاء العضلات.</li>
	<li>ضع الماوس على سطح تشريح مع الجانب البطني مواجها لأعلى. تطبيق مرهم البيطرية العيون في العيون منع الجفاف ومسح كامل السطح البطني للماوس مع منصات الإعدادية الكحول العقيمة مشبعة بالكحول 70% لتطهير.</li>
	<li>جبل الماوس مع كل أربعة أرجل مقيدة.</li>
	<li>فتح تجويف البطن برفق مع أدوات التشريح الجزئي. ويجب الحرص على فتح مجال قدر ممكن دون الأضرار بأي أجهزة الحشوي أو خلق الأنسجة المتدلية.</li>
	<li>برفق فتح تجويف الصدر ببطء إينسيسينج القفص الصدري من خلال منصف. ومن الناحية المثالية، يمكن اقتطعت القفص الصدري من الجانب إلى الجانب. ويجب الحرص الشديد ليس تصيب الجنب الرئتين أثناء فتح تجويف الصدر.</li>
	<li>موقع الأجوف فينا أقل شأنا وجعل شق ينزف الماوس. استخدام منصات القطن ماص لامتصاص الدم.</li>
	<li>ضخ 10 مل الفوسفات المثلج مخزنة المالحة (PBS) في البطين الأيمن (باستخدام 10 مل المحاقن والإبر ز 25) لمسح خلايا الدم الجائل. استيعاب تدفق الدم مع منصات القطن ماصة. بمجرد perfused تماما، ستظهر متبيض الرئتين وثم مستعدون للغسل.</li>
	<li>بلطف قص فتح الجلد والعضلات في الرقبة لفضح مجرى الهواء. عناية المكوس العضلات المجاورة، والغضاريف، والأنسجة الدهنية دون إلحاق الضرر بالقصبة الهوائية.</li>
	<li>إجراء شق صغير (< 2 مم) في القصبة الهوائية الخلفي للحنجرة. ينبغي أن يكون هذا الشق فقط ما يكفي لإدخال قسطرة في حين يزال مربوطا القصبة الهوائية إلى الحنجرة. إدراج قسطرة 22 ز 1 بوصة دون إبرة في القصبة الهوائية إلى الرئتين. تأمين القسطرة مع خياطة مزين حرير (4-0؛ وعدم الامتصاص) مع عقده مربعة. ملاحظة: القسطرة يحتاج إلى تهذيب استناداً إلى حجم الماوس. قصيرة أو طويلة للغاية بالقسطرة تميل إلى تسرب أو تمزق مجرى الهواء أثناء الغسل. يجب أن يكون طول القسطرة مثل أنه عندما تم إدخالها بالكامل يبقى نصيحة جيدا داخل القصبة الهوائية ولا تصل إلى الشعب الهوائية الأولية.</li>
	<li>إرفاق 1 مل حقنه مليئة المثلج بال المخزن المؤقت (Ca2 + و Mg2 + مجاناً برنامج تلفزيوني + 1 ملم حمض الإيثيلين، يدتا) بالقسطرة وغرس المخزن المؤقت ببطء إلى الرئتين. وهذا سوف تضخم الرئتين. الاحتفاظ بحقنه تعلق بالقسطرة لمدة خمس ثوان وثم نضح السوائل الغسل بلطف سحب المكبس. وهذا سوف تنكمش الرئتين. جمع السائل في أنبوب مخروطي 15 مل على الجليد.</li>
	<li>كرر "الخطوة 1، 10" لتسع مرات أكثر وتجمع السائل الغسل. عدم تجاوز المخزن المؤقت 1 مل كل تدفق، التي قد تتجاوز قدرة الرئة وتؤدي إلى تمزق.</li>
	<li>Euthanize الماوس مع CO2 جرعة IACUC الموافقة على البروتوكول.</li>
	<li>الطرد المركزي السائل 10 مل BAL في 250 g x عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بيليه خلية يحتوي على خلايا بال. تنبيه: بيليه قد تكون صغيرة جداً، لذا توخي الحذر عند يسفط المادة طافية.</li>
	<li>ريسوسبيند خلايا ال 100 ميكروليتر من تدفق/الفرز المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني + + + يدتا 1 مم 2% الحرارة إبطال مصل الدم البقري الجنين (FBS) 25 مم حمض N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (حبيس)).</li>
	<li>منع الربط جسم غير محدد لمستقبلات Fc بإضافة كتلة Fc الماوس (استنساخ 2.4G2، 10 ميكروغرام/مل) وحضانة لمدة 20 دقيقة على الجليد.</li>
	<li>أداء جسم تلطيخ جنبا إلى جنب مع الأسفار ناقص واحد (FMO) ووصمة عار واحد يتحكم11،25. تقييم ال (انظر الجدول للمواد) يليه الخلايا بمحلل خلية خلية واحدة التدفق الخلوي التحليل ببرمجيات التحليل المناسب (انظر الجدول للمواد).</li>
	<li>عزل هيئة علماء المسلمين بخلية تنشيط fluorescence أرز (انظر الجدول للمواد) مباشرة إلى الماوس 1 مل أنا المتوسطة الثقافة عندما تهدف هيئة علماء المسلمين للثقافة في المختبر أو في فيفو نقل الخلية. وبدلاً من ذلك، (انظر الجدول للمواد) تستكمل فرز هيئة علماء المسلمين في المخزن المؤقت لتحلل 1 مل مع 10 ميكروليتر/مل β-ميركابتوثانول لاستخراج الحمض النووي الريبي.</li>
</ol>2-عزل هيئة علماء المسلمين من الماوس الرئة، تعليق خلية واحدة
<ol><li>تخدير ماوس C57BL/6 عمرها 8 أسبوع مع الكيتامين (87.5 مغ/كغ من وزن الجسم) وإكسيلازيني (12.5 مغ/كغ من وزن الجسم) كوكتيل عبر حقن داخل. المتابعة عند بلوغ الماوس التخدير الجراحي مع فقدان ردود الفعل واسترخاء العضلات.</li>
	<li>ضع الماوس على سطح تشريح مع الجانب البطني مواجها لأعلى. تطبيق مرهم البيطرية العيون في العيون منع الجفاف ومسح كامل السطح البطني للماوس مع منصات الكحول العقيمة مشبعة بالكحول 70% لتطهير.</li>
	<li>جبل الماوس مع كل أربعة أرجل مقيدة.</li>
	<li>فتح تجويف البطن برفق مع أدوات التشريح الجزئي. ويجب الحرص على فتح مجال قدر ممكن دون الأضرار بأي أجهزة الحشوي أو خلق الأنسجة المتدلية.</li>
	<li>برفق فتح تجويف الصدر ببطء إينسيسينج القفص الصدري من خلال منصف. ومن الناحية المثالية، يمكن اقتطعت القفص الصدري من الجانب إلى الجانب. ويجب الحرص الشديد ليس تصيب الجنب الرئتين أثناء فتح تجويف الصدر.</li>
	<li>موقع الأجوف فينا أقل شأنا وجعل شق ينزف الماوس. استخدام منصات القطن ماص لامتصاص الدم.</li>
	<li>ضخ 10 مل المثلج برنامج تلفزيوني في البطين الأيمن (باستخدام 10 مل المحاقن والإبر ز 25) لمسح خلايا الدم الجائل. بمجرد perfused تماما، ستظهر متبيض الرئتين وجاهزة للحصاد.</li>
	<li>تشريح خارج الرئتين بقطع القصبة الهوائية والأوعية الدموية والأربطة في أنبوب مخروطي 15 مل مع 5 مل البرد المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو (دميم). الحفاظ عليه على الجليد حتى الخطوة التالية.</li>
	<li>Euthanize الماوس مع CO2 جرعة IACUC الموافقة على البروتوكول.</li>
	<li>نقل الرئتين perfused إلى طبق ثقافة عقيمة وخالية من مولد 60 ملم مع 3 مل دميم. مع مساعدة من تشريح الملقط ندف الخطوط الجوية وغيرها من المواد الصلبة غير الرئة الأنسجة، إذا كانت موجودة. تخطر على أنسجة الرئة مع مشرط إلى < حجم 1 مم.</li>
	<li>إضافة 300 ميكروغرام/مل "ليبيراسي ليرة تركية" و 5 U/mL الدناز أنا، مزيج من بيبيتينج واحتضانها في 37 درجة مئوية في حاضنة لمدة 25 دقيقة. بلطف المزيج مرة واحدة قبل بيبيتينج بعد 10 دقائق.</li>
	<li>يمر الرئتين ينتابها 100 ميكرومتر خلية مصفاة مثبتة على أنبوب مخروطي 50 مل. استخدام الجزء الخلفي من المكبس من حقنه 1 مل إلى الهريس حتى كتل الخلية في عامل التصفية. يجب غسل الفلتر مع 20 مل أغسل المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني + 2% الحرارة المعطل FBS + 2 مم يدتا).</li>
	<li>الطرد المركزي في 500 غرام x عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 20 مل.</li>
	<li>كرر الخطوتين 2.12 و 2.13 مرتين، تغيير عامل التصفية والانبوب في كل مرة. مغطس قبل التصفية في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي لأكثر من خمس دقائق يزيد الغلة صباحا. إعداد تعليق خلية واحدة بإضافة 100 ميكروليتر تدفق/الفرز المخزن المؤقت إلى بيليه الخلية.</li>
	<li>منع الربط جسم غير محدد لمستقبلات Fc بإضافة كتلة Fc الماوس (استنساخ 2.4G2، 10 ميكروغرام/مل) وحضانة لمدة 20 دقيقة على الجليد.</li>
	<li>أداء جسم تلطيخ جنبا إلى جنب مع FMO وعناصر تحكم مفردة-وصمة عار11،25. تقييم الرئة (انظر الجدول للمواد) متبوعاً بالخلايا بمحلل خلية خلية واحدة التدفق الخلوي التحليل بتحليل البرمجيات.</li>
	<li>AMs الفرز قبل أرز خلية (انظر الجدول للمواد) مباشرة إلى الماوس 1 مل أنا المتوسطة الثقافة عندما تهدف هيئة علماء المسلمين للثقافة في المختبر أو في فيفو نقل الخلية. وبدلاً من ذلك، فرز مقياس الدعم الكلي إلى 1 مل تحلل المخزن المؤقت تستكمل مع 10 مل ميكروليتر/β-ميركابتوثانول لاستخراج الحمض النووي الريبي.</li>
</ol>3-عزل هيئة علماء المسلمين من البشر بال السائل
<ol><li>ترتيب نقل السائل بال البشرية من العيادة إلى المختبر في 4 درجات مئوية.</li>
	<li>الطرد المركزي بال السائل (10-50 مل) في 250 g x عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بيليه خلية يحتوي على خلايا بال11.</li>
	<li>أغسل بيليه مع 20 مل أغسل المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني + 2% الحرارة المعطل FBS + 2 مم يدتا) وأجهزة الطرد المركزي في 250 g x عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>ريسوسبيند خلايا BAL في 100 ميكروليتر من تدفق/الفرز المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني + 2% الحرارة المعطل FBS يدتا 1 مم + 25 مم حبيس).</li>
	<li>كتلة الربط جسم غير محدد لمستقبلات Fc بإضافة كتلة Fc البشرية (استنساخ Fc1.3070، 25 ميكروغرام/مل) وحضانة لمدة 20 دقيقة على الجليد.</li>
	<li>أداء جسم تلطيخ جنبا إلى جنب مع FMO وعناصر تحكم مفردة-وصمة عار11،24. تقييم ال (انظر الجدول للمواد) متبوعاً بالخلايا بمحلل خلية خلية واحدة التدفق الخلوي التحليل بتحليل البرمجيات.</li>
	<li>AMs الفرز قبل أرز خلية (انظر الجدول للمواد) مباشرة إلى 1 مل ص البشرية الثقافة المتوسطة أو 1 مل تحلل المخزن المؤقت تستكمل مع 10 ميكروليتر/مل β-ميركابتوثانول.</li>
</ol>4. في المختبر الثقافة من AMs
<ol><li>وبعد فرز الخلايا، الحصاد الخلايا التي سينتريفوجينج في 250 g x عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>ريسوسبيند مقياس الدعم الكلي البشرية في 1 مل ص البشرية الثقافة المتوسطة [روزويل بارك التذكاري المعهد المتوسط (ربمي) 1640 تستكمل مع 10% FBS، 20% L-929 الثقافة طافية (كمصدر لمستعمرة بلعم حفز عامل (م-CSF)، 100 يو/مليلتر تركيز النهائي)، بيروفات صوديوم 1 مم، 10 ملم حمض N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (حبيس)، و 1 x البنسلين/ستربتوميسين (اختياري)]. وبالمثل، ريسوسبيند الماوس مقياس الدعم الكلي في 1 مل الماوس المتوسطة الثقافة صباحا [دميم وتستكمل مع 10% FBS والثقافة L-929 20% بيروفات صوديوم طافية (كمصدر ل M-CSF، 100 يو/مليلتر تركيز النهائي)، 1 مم، 10 مم حبيس 1 x البنسلين/ستربتوميسين (اختياري )].</li>
	<li>تعداد تريبان الأزرق-باستثناء الخلايا قابلة للتطبيق بعداد خلايا وضبط تركيز خلية قابلة للتطبيق في 1 × 106/mL. ملاحظة: من الناحية المثالية، تصل إلى 5 × 105 هيئة علماء المسلمين يمكن أن تكون معزولة عن بال السائل التي تم جمعها من ماوس ذكور C57BL/6 أسبوع 8-10 قديمة. العائد صباحا من هضم الرئة الماوس هو متغير وقد يكون أقل قليلاً من السائل الماوس بال. صباحا العائد من السوائل بال البشرية يعتمد على حجم السائل بال، أن إجمالي حجم المياه المالحة التي تستخدم في الغسل، وحالة المريض السريرية.</li>
	<li>استناداً إلى الغلة وضرورة التجريبية، بذور الخلايا الموجودة في الشرائح الدائرة أو أطباق الثقافة أو قوارير الثقافة. ومن الناحية المثالية، البذور مقياس الدعم الكلي في 1 × 105/mL مع متوسطة 10 مل في قارورة زراعة الأنسجة T25.</li>
	<li>احتضان الخلايا في حاضنة هوميديفيد مع 5% CO2 الغلاف الجوي 37 درجة مئوية. ملاحظة: سوف تنمو كخلايا ملتصقة هيئة علماء المسلمين وهي النمو البطيء جداً (مضاعفة الوقت > 7 أيام).</li>
	<li>في 24 ساعة بعد البذر، ينبغي أن تكون هيئة علماء المسلمين تمسكا وسوف لا يمكن فصل قبل تغيير لطيف للثقافة المتوسطة. إزالة المتوسطة بتطلع من طرف واحد، وتجديد مع الطازجة المتوسطة استعد مسبقاً إلى 37 درجة مئوية. ملاحظة: يمكن الآن أن الخلايا تستخدم لتقييم الفيزيولوجيا صباحا أو آثار المنبهات. هيئة علماء المسلمين التي نمت في شرائح الدائرة يمكن أن تكون الملون مريح مع الأجسام المضادة المناسبة، وتعتبر مثالية للتصور مجهرية. لتقييم تدفق سيتوميتريك، يتم حصاد مقياس الدعم الكلي بالحضانة مع الخلية غير الانزيمية الناي بالحل.</li>
	<li>نضح المتوسطة الثقافة وإضافة حل الناي بما يكفي لتغطية سطح الثقافة (حوالي 2 مل في قارورة T25) واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق. إلغاء لا سيكون ضروريا، ولا ينصح كشط الخلايا ميكانيكيا. اضغط برفق الجانبين وإضافة 1-2 مل تدفق/الفرز المخزن المؤقت بلطف "الماصة؛" صعودا ونزولاً فصل معظم الخلايا ملتصقة.</li>
	<li>لدراسات الحمض النووي الريبي، والخلايا مباشرة على الطبق الثقافة عن طريق إضافة تحلل المخزن المؤقت.</li>
</ol>

<ol><li>Westphalen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sessile+alveolar+macrophages+communicate+with+alveolar+epithelium+to+modulate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity.</a> Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).</li>
<li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+develop+from+fetal+monocytes+that+differentiate+into+long-lived+cells+in+the+first+week+of+life+via+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF.</a> J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).</li>
<li>Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+prevent+lethal+influenza+pneumonia+by+inhibiting+infection+of+type-1+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells.</a> PLoS Pathog. 13 (1), e1006140(2017).</li>
<li>Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+alveolar+macrophages+during+influenza+infection+facilitates+bacterial+superinfections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections.</a> J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).</li>
<li>MacLean, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequestration+of+inhaled+particulate+antigens+by+lung+phagocytes.+A+mechanism+for+the+effective+inhibition+of+pulmonary+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity.</a> Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).</li>
<li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+alveolar+macrophages+by+clodronate-liposomes+aggravates+ischemia-reperfusion+injury+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung.</a> J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).</li>
<li>Schneider, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+are+essential+for+protection+from+respiratory+failure+and+associated+morbidity+following+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection.</a> PLoS Pathog. 10 (4), e1004053(2014).</li>
<li>Pribul, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+are+a+major+determinant+of+early+responses+to+viral+lung+infection+but+do+not+influence+subsequent+disease+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development.</a> J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).</li>
<li>Macdonald, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+alveolar+macrophages+for+sustained+mucosal+T-cell+recall+confers+long-term+protection+to+mice+against+lethal+influenza+challenge+without+clinical+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease.</a> Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).</li>
<li>Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+alveolar+macrophage+depletion+on+liposomal+vaccine+protection+against+respiratory+syncytial+virus+%28RSV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV).</a> Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).</li>
<li>Nayak, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+of+donor+alveolar+macrophages+in+human+lung+transplant+recipients+that+influences+donor+specific+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses.</a> Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).</li>
<li>Sekine, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+passenger+leukocytes+in+allograft+rejection%3A+effect+of+depletion+of+donor+alveolar+macrophages+on+the+local+production+of+TNF-alpha%2C+T+helper+1%2FT+helper+2+cytokines%2C+IgG+subclasses%2C+and+pathology+in+a+rat+model+of+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation.</a> J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).</li>
<li>Borie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+alveolar+proteinosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+Rev%22%5BJournal%5D)">Pulmonary alveolar proteinosis.</a> Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).</li>
<li>Greenhill, S. R., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+alveolar+proteinosis%3A+a+bench-to-bedside+story+of+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction.</a> Chest. 136 (2), 571-577 (2009).</li>
<li>Happle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+transplantation+of+macrophage+progenitors+as+effective+and+long-lasting+therapy+for+hereditary+pulmonary+alveolar+proteinosis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis.</a> Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113(2014).</li>
<li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+macrophage+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pulmonary macrophage transplantation therapy.</a> Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).</li>
<li>Hashimoto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages+self-maintain+locally+throughout+adult+life+with+minimal+contribution+from+circulating+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes.</a> Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).</li>
<li>Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prolonged+life-span+of+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The prolonged life-span of alveolar macrophages.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).</li>
<li>Maus, U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+alveolar+macrophages+are+replaced+by+recruited+monocytes+in+response+to+endotoxin-induced+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).</li>
<li>Perdiguero, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages+originate+from+yolk-sac-derived+erythro-myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors.</a> Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).</li>
<li>Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophage+replication.+One+mechanism+for+the+expansion+of+the+mononuclear+phagocyte+population+in+the+chronically+inflamed+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung.</a> J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).</li>
<li>Misharin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-derived+alveolar+macrophages+drive+lung+fibrosis+and+persist+in+the+lung+over+the+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span.</a> J Exp Med. , (2017).</li>
<li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+pulmonary+intravascular+nonclassical+monocytes+recruit+recipient+neutrophils+and+mediate+primary+lung+allograft+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction.</a> Sci Transl Med. 9 (394), (2017).</li>
<li>Nayak, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zbtb7a+induction+in+alveolar+macrophages+is+implicated+in+anti-HLA-mediated+lung+allograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection.</a> Sci Transl Med. 9 (398), (2017).</li>
<li>Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+macrophages+and+dendritic+cell+subsets+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).</li>
<li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+function+of+lung-resident+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells.</a> Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).</li>
<li>Eguiluz-Gracia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+of+human+donor+alveolar+macrophages+in+lung+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients.</a> Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).</li>
<li>Yu, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood%2C+bronchoalveolar+lavage%2C+and+lung+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).</li>
</ol>

الكتاب قد لا يوجد تضارب في إعلان.

هيئة علماء المسلمين هي الضامة المقيم في الرئة الحية الطويلة التي ملء الرئتين تبدأ عند الولادة ودائمة على مدى طوال فترة الحياة26. تم الاعتراف بأدوارهن في7 وعلم الأمراض الرئوية علم وظائف الأعضاء12 وقدرتها على التنبؤ بالمناعة الذاتية الرئوية24 . لأن مقياس الدعم الكلي لها وجود طويل الأجل في الرئتين11،27 و لأنها تشارك في تنشيط وتقدم الاستجابات المناعية11</...

المكروية الرئة نظام إيكولوجي فريد معقدة مع قناة الهواء تفصيلاً والمفرج. ويسافر الهواء المستنشق عن طريق القصبة الهوائية وفروع عديدة من القصبات والقصيبات قبل أن تصل إلى الحويصلات الهوائية، التي يحدث فيها تبادل الغازات الجوية الدم. نظراً للتفاعل المباشر مع الغلاف الجوي، يتطلب السطح التنفسي الحماية من الآثار الضارة المحتملة للجسيمات العالقة في الهواء والملوثات. عدد من الحواجز المادية والكيميائية والمناعية حماية الرئتين. جدير بالذكر أن نشر البالعات في السطح التنفسي يخدم نظام الدفاع السطر الأول هام. البلاعم السنخية (هيئة علماء المسلمين) نوع واحد من البالعات المقيم في الرئة، ويشكلون الغالبية العظمى من تجمع بلعم الرئة. وكما يوحي اسمها، هيئة علماء المسلمين هي أساسا مترجمة إلى التجويف السنخية وتحدث كخلايا لاطئة الذي عينة في الغلاف الجوي المحيط باستمرار والتواصل مع ظهارة السنخية1. في حالة مستقرة الرئتين، أكثر من 95 في المائة البالعات في الفضاء السنخية هي مقياس الدعم الكلي2، تشكيلها قد تغير بسبب الالتهاب أو العدوى أو التعرض المزمن للملوثات.
هيئة علماء المسلمين المشاركة في مجموعة واسعة من الوظائف التي قد تكون محلية إلى الرئتين و/أو ذات الأهمية الشاملة. على سبيل المثال، هيئة علماء المسلمين تعتبر أساسية في التنمية والأداء الأمثل للرئتين؛ المراقبة المناعية؛ وإزالة الحطام الخلوية والغازية المسببة للأمراض، واستنشاق الجسيمات3،،من45،،من67. استنفاد المستهدفة من هيئة علماء المسلمين المعروف أن تنال من إزالة فيروسات الجهاز التنفسي والبكتيريا4،8. وإلى جانب دورها البالعات والمدافعين عن السطر الأول من التوازن الرئوية، معروفة مقياس الدعم الكلي وظيفتها كما عرض مستضد الخلايا في استخلاص تي الخلية9من الحصانة، potentiating فعالية اللقاحات داخل الآنف10 و التأثير على المناعة الذاتية المقيدة-الرئة بعد زرع الرئة11،12. ارتبط نقص في وظيفة صباحا إلى بروتينوسيس السنخية الرئوية (PAP)، شرط الناتجة عن الطفرات الوراثية، خبيثة أو الإصابة التي يعوق إزالة التوتر السطحي الرئوي13،14. يجري الآن بحث زرع الكلي كنهج علاجية للعلاج من PAP 15،16.
مقياس الدعم الكلي المعروف أن تنشأ أثناء امبريوجينيسيس وأن تستمر في الرئتين طوال الحياة دون محلها تعميم الكريات البيضاء2،17. وعلى الرغم من دوران الساعة غير قابل للكشف في الرئتين التماثل الساكن، أبلغ مستويات متفاوتة من دوران صباحا في بعض الشروط السريرية بما في ذلك الإصابة بفيروس الإنفلونزا4، تشعيع ميلوابلاتيفي18، والتعرض إلى الذيفان في سن 19، وتبلغ من العمر20. يعتقد أن مقياس الدعم الكلي لتجديد ذاتيا عن طريق انتشار منخفضة الدرجة17،21، ولكن المطالبة ببعض الدراسات التي أجريت مؤخرا أن وحيدات يمكن أن تؤدي إلى عدد سكان من الرئة داخل الأوعية الضامة22،23 في إطار الظروف التجريبية، لكن الأداء الوظيفي لهذه الضامة الرئوية المحولة حديثا لم يتم تعريفها في أمراض الرئة. وعلاوة على ذلك، فهم عتبة التحفيز في سياق التنشيط صباحا منطقة يحتمل أن تكون مثيرة لاهتمام، والرئة محاولات للحفاظ على توازن بين الإشارات التحريضية والآلات إيمونوريجولاتوري.
التغييرات الفسيولوجية أو باثولوجي التي تؤدي إلى فقدان التنظيم المناعي مهمة تقييم في ظروف سريرية مختلفة (مثل التهابات الجهاز التنفسي وأمراض التهاب الرئة وأمراض الرئة تليفية). ومع ذلك، تزايد الاعتراف هيئة علماء المسلمين كمؤشرات أو حتى محددات الصحة الرئوية11،24. حاليا، لا تتوفر أية بروتوكولات موحدة للحصاد، وتميز، و/أو الحفاظ على هيئة علماء المسلمين من البشر ونماذج مورين الإكلينيكية. عدم وجود توافق في الآراء بشأن السلائف صباحا وتعمل، وعدم وجود منهجية مفصلة كان الحاجز الرئيسي في دور (أدوار) أتاح للساعة في الصحة الرئوية وأمراض. ويوفر البروتوكول التالي تحديد نهائي، والعزلة، و في المختبر استراتيجية الثقافة إلى حد كبير تحسين فهم السلوك صباحا، وتيسير الدراسات التشخيصية والعلاجية التي استهدفت صباحا.

<table><tbody><tr><td>محلول تفكيك الخلايا غير الأنزيمي</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet Ointment</td><td>Dechra</td><td>620300</td><td></td></tr><tr><td>22G قسطرة &nbsp ؛</td><td>Terumo Medical Products</td><td>SR-OX2225CA</td><td></td></tr><tr><td>4-0 خياطة مضفرة حريرية غير قابلة للامتصاص&nbsp;</td><td>كينت ساينتفيك</td><td>SUT-15-2</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco s فوسفات مخزن محلول ملحي&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>ماوس Fc block&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Lysis Buffer (PureLink RNA Kit) Thermo</td> <td>Fisher Scientific &nbsp ؛</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>ب-Mercaptoethanol&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M6250&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria II فارز الخلايا&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>الكيتامين &nbsp ؛ (كيتاثيسيا)</td><td>Henry Schein</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine&nbsp; (أناشد)</td><td>Akorn</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL & nbsp ؛</td><td>Millipore-Sigma</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore-Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>100 & mu ؛ مصفاة الخلايا المم&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Human Fc block</td><td>BD Biosciences</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Countess II عداد الخلايا الآلي</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>تريبان بلو سوليوششن</td><td>ثيرمو فيشر العلمية&nbsp;</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنيني</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>خط الخلايا L-929</td><td>مجموعة الثقافة الأمريكية</td><td>ATCC ، &nbsp ؛ CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>البنسلين / الستربتومايسين &nbsp ؛</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>T25 قارورة زراعة</td><td>الأنسجة Thermo Fisher Scientific &nbsp;</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>طبق ثقافة 60 مم &nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>CLS3261</td><td></td></tr><tr><td>15 مل أنبوب مخروطي &nbsp;</td><td>كورنينج</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 مل أنبوب مخروطي &nbsp;</td><td>محلل خلايا Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa</td><td>BD Biosciences</td><td>657669</td><td></td></tr> برنامج تحليل <tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>v10.4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45 (الماوس) Biolegend</td><td></td> <td>147709</td><td>استنساخ I3 / 2.3 ، FITC المترافق</td></tr><tr><td>Anti-CD11b (الماوس) Biolegend</td><td></td> <td>101228</td><td>استنساخ M1 / 70 ، PerCP / Cy5.5 مترافق</td></tr><tr><td>مضاد CD11c (الماوس)</td><td>BD Biosciences</td><td>565452</td><td>استنساخ N418 ، BV 421 مترافق</td></tr><tr><td>مضاد I-Ab (فأر) Biolegend</td><td></td> <td>116420</td><td>استنساخ AF6-120.1 ، PE / Cy7 مترافق</td></tr><tr><td>مضاد Siglec-F (فأر) BD</td> <td>Biosciences</td><td>562757</td><td>استنساخ E50-2440 ، PE-CF594 مترافق</td></tr><tr><td>مضاد Siglec-H (ماوس)</td> <td>Biolegend</td><td>129605</td><td>استنساخ 551 ، PE مترافق</td></tr><tr><td>مضاد F4 / 80 (فأر)</td> <td>Biolegend</td><td>123118</td><td>استنساخ BM8 ، APC / Cy7 مترافق</td></tr><tr><td>Anti-Ly-6C (فأر)</td> <td>Biolegend</td><td>128035</td><td>استنساخ HK1.4 ، BV605 مترافق</td></tr><tr><td>مضاد ل CD64 (ماوس)</td> <td>Biolegend</td><td>139311</td><td>استنساخ X54-5 / 7.1 ، BV711 مترافق</td></tr><tr><td>مضاد ل CD24 (فأر) BD</td> <td>Biosciences</td><td>563115</td><td>استنساخ M1 / 69 ، BV510 مترافق</td></tr><tr><td>مضاد ل CD103 (ماوس)</td> <td>BD Biosciences</td><td>745305</td><td>استنساخ OX-62 ، BV650 مترافق</td></tr><tr><td>مضاد ل CD317 (ماوس)</td> <td>Biolegend</td><td>127015</td><td>استنساخ 927 ، APC مترافق</td></tr><tr><td>مضاد ل CXCR1 (ماوس)</td> <td>Biolegend</td><td>149029</td><td>استنساخ SA011F11 ، BV785 مترافق</td></tr><tr><td>مضاد CD45 (إنساني)</td> <td>Biolegend</td><td>304017</td><td>استنساخ HI30 ، AF488 مترافق</td></tr><tr><td>مضاد ل CD11b (إنساني)</td> <td>Biolegend</td><td>101216</td><td>استنساخ M1 / 70 ، PE / Cy7 مترافق</td></tr><tr><td>Anti-HLA-DR (Human)</td> <td>Biolegend</td><td>307618</td><td>استنساخ L243 ، APC / Cy7 مترافق</td></tr><tr><td>مضاد CD169 (إنساني)</td> <td>Biolegend</td><td>346008</td><td>استنساخ 7-239 ، APC مترافق</td></tr><tr><td>Anti-CD206 (Human)</td> <td>Biolegend</td><td>321106</td><td>Clone 15-2 ، PE مترافق</td></tr><tr><td>Anti-CD163 (Human)</td> <td>Biolegend</td><td>333612</td><td>استنساخ GHI / 61 ، BV421 مترافق</td></tr></tbody></table>

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

البلاعم السنخية هي الضامة الميؤوس من شفائهم المتباينة، والمقيم في الرئة الأصلية قبل الولادة. البلاعم السنخية فريدة من نوعها في حياتها الطويلة ودورها الهام في تنمية الرئة ووظيفة، فضلا عن ردودها المترجمة بالرئة بالعدوى والالتهابات. وحتى الآن، لا توجد طريقة موحدة لتحديد الهوية والعزلة، والتعامل مع البلاعم السنخية من البشر والفئران موجود. مثل هذا أسلوب ضروري لإجراء دراسات عن هذه الخلايا المناعية الفطرية الهامة في مختلف البيئات التجريبية. الأسلوب الموصوفة هنا، الذي يمكن اعتماده بسهولة بأي مختبر، نهج مبسطة لحصاد البلاعم السنخية من سائل الغسل للفيسيولوجيا أو من أنسجة الرئة والحفاظ عليها في المختبر. لأن السنخية الضامة يحدث أساسا كخلايا ملتصقة في الحويصلات الهوائية، هذا الأسلوب ينصب التركيز على إزاحة لهم قبل الحصاد، وتحديد الهوية. الرئة جهاز فاسكولاريزيد عالية، وتسكن مختلف أنواع الخلايا المنشأ النقوي واللمفاوية، والتفاعل، وتتأثر المكروية الرئة. باستخدام مجموعة علامات السطح الموصوفة هنا، الباحثين يمكن بسهولة وبشكل لا لبس فيه تمييز البلاعم السنخية من الكريات البيضاء الأخرى، وتنقية لهم طلبات المتلقين للمعلومات. الأسلوب الثقافة المتقدمة هنا يدعم كلا الإنسان والفأر البلاعم السنخية للنمو في المختبر ، ومتوافقة مع الدراسات الخلوية والجزيئية.

نهج سيتوميتريك تدفق لتحديد الماوس AMs يرد في الشكل 1. وهذا يشمل تحليل لمجموعة الحد الأدنى من العلامات السطحية اللازمة في التمييز بين هيئة علماء المسلمين من البالعات الأخرى المقيمة في الرئة أو التسلل إلى الرئة. مطلوب تحليل تفاضلي للتعرف على مقياس الدعم الكلي من الضامة المتداخلة، والخلايا الجذعية، العَدلات، وحيدات، والمشتقة من الوحيدات الضامة الرئوية التي تحدث في الرئتين. مخطط السطح علامات التالية يمكن أن تستخدم لسهولة التمييز بين أنواع هذه الخلايا من بعضها الب...

ويصف هذا البلاغ موريني نماذج لأغراض تجريبية ومنهجيات للعزلة وثقافة البلاعم السنخية من البشر.

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل البلاعم السنخية البشرية والفئران من الرئتين والسائل الغسيل القصبي السنخي وتطوير طريقة لثقافتها في المختبر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على بعض الأسئلة الرئيسية في مجال مناعة الرئة ، مثل دور البلاعم السنخية في عدوى الجهاز التنفسي والالتهابات والمناعة الذاتية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على تمييز البلاعم السنخية عن كريات البيض الرئوية الأخرى والحصول على مجموعة من البلاعم السنخية عالية النقاء للأغراض التجريبية.ضع فأرة مخدرة على سطح تشريح بحيث يكون الجانب البطني متجها لأعلى. ضع مرهما بيطري للعيون على العينين لمنع الجفاف. امسح السطح البطني للفأر بالكامل بضمادات تحضير كحولية معقمة ، مشبعة بنسبة 70٪ من الأيزوبروبانول ، للتطهير.قم بتركيب الماوس مع الاحتفاظ بجميع الأرجل الأربع. افتح تجويف البطن برفق باستخدام أدوات التشريح الدقيقة. يجب توخي الحذر لفتح أكبر قدر ممكن من المساحة دون الإضرار بأي أعضاء حشوية أو تكوين أنسجة متدلية.افتح التجويف الصدري برفق عن طريق شق القفص الصدري ببطء عبر المنصف من الناحية المثالية ، يمكن استئصال القفص الصدري من جانب إلى آخر. يجب توخي الحذر الشديد حتى لا تؤذي غشاء الجنب في الرئتين أثناء فتح التجويف الصدري.حدد موقع الوريد الأجوف السفلي وقم بعمل شق لنزيف الفأر. استخدم ضمادات قطنية ماصة لامتصاص الدم. حقن 10 ملليلتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج في البطين الأيمن لطرد خلايا الدم المنتشرة.امتصاص تدفق الدم باستخدام ضمادات قطنية ماصة. بمجرد أن تتدفق تماما ، ستظهر الرئتان مبيضتين ثم تكون جاهزة للغسل. افتح الجلد والعضلات في الرقبة برفق لكشف مجرى الهواء.استئصال العضلات والغضاريف والأنسجة الدهنية المجاورة بعناية ، دون الإضرار بالقصبة الهوائية. بعد ذلك ، قم بعمل شق صغير في القصبة الهوائية ، خلف الحنجرة. يجب أن يكون هذا الشق كافيا لإدخال قسطرة بينما لا تزال القصبة الهوائية متصلة بالحنجرة.تتمثل الخطوة الوحيدة الأكثر أهمية في جمع سائل BAL في توصيل قسطرة بإحكام بالقصبة الهوائية لتقليل التسرب أثناء الغسيل. أدخل قسطرة قياس 22 بوصة واحدة بدون إبرة في القصبة الهوائية باتجاه الرئتين. قم بتأمين القسطرة بخياطة مضفرة من الحرير وعقدة مربعة.وجود أيدي قوية واتباع هذه الخطوة ، يمنع ببطء وبلطف تمزق القصبة الهوائية والرئتين. قم بتوصيل حقنة سعة مليلتر واحد ، مملوءة بمحلول BAL المثلج البارد بالقسطرة وغرس المخزن المؤقت ببطء في الرئتين. سيؤدي ذلك إلى تضخيم الرئتين.احتفظ بالمحقنة متصلة بالقسطرة لمدة خمس ثوان، ثم استنشق سائل الغسيل عن طريق سحب المكبس برفق. سيؤدي ذلك إلى تفريغ الرئتين. اجمع السائل في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر ، يوضع على الثلج.كرر التضخم والانكماش تسع مرات أخرى ، وقم بتجميع سائل الغسيل. لا تتجاوز ملليلتر واحد من المخزن المؤقت لكل تدفق ، لأن ذلك قد يتجاوز سعة الرئة ويؤدي إلى تمزقها. جهاز الطرد المركزي 10 مل من سائل BAL عند 250 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.تحتوي حبيبات الخلية على خلايا BAL. أعد تعليق خلايا BAL في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز التدفق. تابع تلطيخ الخلايا وفرزها كما هو موضح في بروتوكول النص.قم بإعداد فأر مخدر للتشريح ، وقم بإجراء شقوق ونزيف الماوس كما كان من قبل. حقن 10 ملليلتر من PBS المثلج في البطين الأيمن لطرد خلايا الدم المنتشرة. بمجرد أن تتدفق تماما ، ستظهر الرئتان مبيضتين وجاهزتين للحصاد.قم بتشريح الرئتين عن طريق قطع القصبة الهوائية والأوعية الدموية والأربطة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر ، مع خمسة ملليلتر من DMEM البارد. احتفظ به على الجليد حتى الخطوة التالية. انقل الرئتين المنفوختين إلى طبق استزراع معقم وخالي من البيروجين 60 ملم مع ثلاثة ملليلتر من DMEM.بمساعدة ملقط التشريح ، قم بإخراج الشعب الهوائية وغيرها من مواد الأنسجة الصلبة غير الرئوية ، إن وجدت. افرم أنسجة الرئة بمشرط إلى أقل من ملليمتر واحد. أضف 300 ميكروغرام لكل مليلتر من Liberase TL ، وخمس وحدات لكل مليلتر من DNAse واحد.تخلط عن طريق سحب العينات وتحتضن على حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة لمدة 25 دقيقة. بعد 10 دقائق ، اخلطي برفق مرة واحدة عن طريق سحب العينات. مرر الرئتين المنفصلتين عبر مصفاة خلية 100 ميكرون مثبتة على أنبوب مخروطي سعة 50 مل.استخدم الجزء الخلفي من المكبس من حقنة سعة مليلتر واحد لهرس كتل الخلايا على الفلتر. اغسل الفلتر ب 20 مل من محلول الغسيل. جهاز طرد مركزي عند 500 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 20 مل من محلول الغسيل. كرر خطوات الإجهاد والطرد المركزي مرتين ، مع تغيير الفلتر والأنبوب في كل مرة. أخيرا ، قم بإعداد تعليق الخلية المفردة عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز التدفق إلى حبيبات الخلية.قم بإجراء تلطيخ الأجسام المضادة وفرز الخلايا ، كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد فرز الخلايا ، قم بحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 250 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. أعد تعليق AMs الماوس في مليلتر واحد من وسط ثقافة AM للفأر.بناء على المحصول والضرورة التجريبية ، قم بزرع الخلايا في شرائح الغرفة أو أطباق الثقافة أو قوارير الاستزراع. من الناحية المثالية ، قم بزرع AMs بمعدل 100،000 لكل مليلتر مع 10 ملليلتر من الوسط في قارورة زراعة الأنسجة T 25. احتضان الخلايا في حاضنة رطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪.في غضون 24 ساعة من البذر ، يجب أن تكون AMs ملتزمة ولن يتم فصلها عن طريق تغيير لطيف في وسط الاستزراع. قم بإزالة الوسط عن طريق الشفط من أحد طرفيه ، وقم بتجديده بوسط طازج دافئ مسبقا إلى 37 درجة مئوية. أخيرا ، راقب القارورة تحت المجهر المقلوب.يظهر تقييم قياس التدفق الخلوي للبلاعم السنخية في سائل الغسيل السنخي للفأر. تم تحديد البلاعم السنخية إيجابية لكونها إيجابية CD45 ، و CD11c إيجابية ، و Siglec-F إيجابية. كما هو موضح هنا ، هو نتيجة تمثيلية للبلاعم السنخية للفأر التي تم زراعتها في المختبر لمدة 24 ساعة.أصبحت الخلايا ملتصقة ولن يؤدي التغيير اللطيف في وسط الثقافة إلى فصلها. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ساعتين تقريبا ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التمييز بين الفأر والبلاعم السنخية البشرية عن خلايا الرئة الأخرى.أيضا ، كإجراءات للحصول على مجموعة جميلة من البلاعم السنخية للتجارب النهائية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه ليست كل الضامة أو الخلايا البلعمية المقيمة في الرئة هي ضامة سنخية. البلاعم السنخية هي نوع من الخلايا المتخصصة الموجودة في الرئتين منذ الولادة.لعزل البلاعم السنخية ، يجب أن يكون التركيز على طرق الاستخراج القابلة للتطبيق من البيئة الدقيقة السنخية. تدعم طريقة الاستزراع في المختبر التي تم تطويرها هنا نمو البلاعم السنخية في حالة معملية يمكن استخدامها في المقايسات الجزيئية والخلوية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل نقل الخلايا بالتبني وعرض المستضد وتقييم الاستجابة للمنبهات الالتهابية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول بيولوجيا البلاعم السنخية.

isolation-vitro-culture-murine-human-alveolar

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

هنا، نحن تصف بروتوكولات لحصاد الضامة السنخية الفئران، التي يقيمون الخلايا المناعية الفطرية في الرئة، ودراسة تفعيل استهلاكهم في استجابة لثقافة بالتعاون مع النانوية polyanhydride.

الخلوي تنشيط حصاد الضامة السنخية الفئران وتقييم المستحث بواسطة النانوية Polyanhydride

نقدم بروتوكول بسيطة وفعالة لتوليد الضامة الإنسان. تتم معالجة الشهباء المعاطف بالنقر المزدوج كثافة التدرج الطرد المركزي ومن ثم يتم التمييز حيدات معزولة لالضامة في أكياس زراعة الخلايا المغلفة تفلون. هذا يعظم عوائد البلاعم ويسهل الحصاد خلية لتجارب لاحقة.

عزل حيدات الإنسان من مزدوجة التدرج الطرد المركزي والتمايز لالضامة في تفلون المغلفة حقائب خلية ثقافة

وهناك طريقة لتقييم قدرة معزولة الضامة السنخية الماوس للسيطرة على نمو الجراثيم المبتلعة من قبل الرشاشيات المجهري متحد البؤر.

تقييم نشاط مضاد للفطريات المعزولة من السنخية الضامة التي كتبها متحد البؤر المجهري

نصف هنا بروتوكولا بسيطا لعزل البلاعم البريتونية في الفئران. يتبع هذا الإجراء استخراج الحمض النووي الريبي لإجراء تحليل التعبير الجيني على تحفيز المستقبلات الشبيهة بالحصان.

عزل الفئران البريتوني الضامة لتنفيذ جين تحليل التعبير عند تول مثل مستقبلات تحفيز

تولد خلايا نخاع العظام المزروعة بعامل تحفيز مستعمرة البلاعم المحبب (GM-CSF) مزرعة غير متجانسة تحتوي على الضامة والخلايا المتغصنة (DCs). تسلط هذه الطريقة الضوء على استخدام ارتباط MHCII و hyaluronan (HA) للتمييز بين البلاعم عن DCs في ثقافة GM-CSF. البلاعم في هذه الثقافة لها العديد من أوجه التشابه مع البلاعم السنخية.

جيل وتحديد GM-CSF المشتقة مثل السنخية الضامة والخلايا الجذعية من الفأر نخاع العظم

يتم تقديم بروتوكول لزراعة الخلايا لعامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) المتمايز من البلاعم البشرية المشتقة من الخلايا الأحادية. يستخدم البروتوكول الحفظ بالتبريد للخلايا الوحيدة إلى جانب تمايزها السائب إلى الضامة. ثم يمكن بعد ذلك زرع البلاعم المحصودة في آبار الاستزراع بكثافات الخلايا المطلوبة لإجراء التجارب.

ثقافة الضامة الوحيدات المستمدة-بلعم مستعمرة تحفيز عامل متباينة الإنسان

هنا نحن تقرير الأساليب الشائعة لتحليل الدالة متجولة مورين البلاعم السنخية وإزالة البكتيريا من الرئة. دراسة هذه الأساليب البلعمه في المختبر من fluorescein isothiocyanate الخرز والمجراه في البلعمه من "بروتين فلوري أخضر" الزائفة الزّنجاريّة . كما يصف لنا طريقة لمسح P. الزّنجاريّة في الفئران.

البلعمه البلاعم السنخية وإزالة البكتيريا في الفئران

ونوصف طريقة لمعالجة سائل غسل القصبات الهوائية ومطابقة الدم المحيطي من الأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية بشكل مزمن على العلاج المضاد للفيروسات العكوسة لتقييم خزانات فيروس نقص المناعة البشرية الرئوية. هذه الأساليب تؤدي إلى الحصول على خلايا CD4 T نقية للغاية والضامة السنخية التي يمكن استخدامها في وقت لاحق لنماذج الفينومينية المناعية وفيروس نقص المناعة البشرية الحمض النووي /RNA القياس الكمي من قبل تفاعل سلسلة بوليميراز حساسة للغاية.

معالجة سائل غسل القصبات الهوائية والدم المتطابق لماكروفاج النفيل وCD4+ النمط المناعي للخلايا T وتقييم خزان فيروس نقص المناعة البشرية

المعروض هنا هو بروتوكول الأمثل لعزل ، والزراعة ، ونقل ، والتفريق بين الخلايا الاساسيه البشرية من الافراد المصابين بالفيروس والضوابط الصحية.

العزلة ، الانتقال ، وثقافة الخلايا البشرية الاوليه

قدم هنا هو بروتوكول لعزلة أحادية الدم الإنسان الأولية وكذلك تمايزها في الضامة والخلايا التشعبية والتجميع مع الخلايا الظهارية في نموذج الرئة البشرية متعددة الخلايا. وتقارن الاستجابات البيولوجية لثقافات النقوش المكونة من خلايا مناعية متمايزة عن الخلايا الأحادية المعزولة حديثا أو المذابة، عند التعرض للمحفزات البهوية.

نموذج القُزلة السنخية البشرية متعددة الخلايا يتكون من الخلايا الظهارية والخلايا المناعية الأولية لتقييم المخاطر

يصف هذا البروتوكول عزل وثقافة البلاعم المشتقة من نخاع العظم من الفئران.

عزل وثقافة البلاعم المشتقة من نخاع العظام من الفئران

تعلم عزل وزراعة البلاعم السنخية من الفئران والبشر في المختبر. توفر هذه الطريقة خلايا نقية عالية لدراسة المناعة الرئوية والأمراض التنفسية.

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

استكشف المزيد من الفيديوهات