النسخ المتماثل لمطلوب، "مكتبة نونريدوندانت" من سلالة الزّنجاريّة Pseudomonas PA14 ينقول طفرات الإدراج

الهدف العام من هذا البروتوكول هو إنشاء نسخ عالية الجودة من مكتبة الينقولات المتحولة المطلوبة وغير الزائدة عن الحاجة لسلالة Pseudomonas aeruginosa PA14 المشار إليها باسم مجموعة PA14NR. يحافظ هذا البروتوكول على سلامة مجموعة PA14NR أثناء النسخ المتماثل ، مما يؤدي إلى إنشاء نسخ عالية الجودة من هذه المكتبة. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه يوفر وصفا تفصيليا لجميع الخطوات المتضمنة في نسخ المكتبة ومراقبة الجودة والتخزين المناسب للطفرات الفردية.

على الرغم من أن هذا البروتوكول قد تم تصميمه لتكرار مجموعة P14NR ، إلا أنه يمكن تكييفه لتكرار المكتبات البكتيرية الأخرى. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب خطر التلوث أثناء عملية النسخ المتماثل. لذلك ، يوفر هذا البروتوكول إرشادات مفصلة خطوة بخطوة لتقليل هذا الخطر.

يوزع مختبرنا مجموعة PA14NR على المجتمع العلمي العالمي. ونوصي بأن يقوم المستخدم النهائي بنسخ المكتبات. لتقديم التوجيه ، نقدم بروتوكولا يوضح بالتفصيل كيفية إنشاء نسخ عالية الجودة من المكتبة.

العرض المرئي لهذا البروتوكول أمرا بالغ الأهمية ، لا سيما الخطوات المصممة لمنع انتقال التلوث. للحماية الذاتية ، بالإضافة إلى حماية الثقافات البكتيرية ، يجب دائما ارتداء معطف المختبر والقفازات والقناع عند التعامل مع المكتبة المتحولة لإدخال الينقولات غير الزائدة عن الحاجة من سلالة P aeruginosa PA14 ، مجموعة PA14NR المعينة. قم بإعداد ألواح LB Agar عن طريق سكب ما يقرب من 60 مل من LB أجار المنصهر في ألواح مستطيلة.

جفف الأطباق في غطاء معقم لمدة ساعة تقريبا قبل الاستخدام. قم بإنشاء حقل معقم باستخدام موقد بنسن على منضدة ممسحة بالإيثانول. وقم بإعداد حاويات مع الحلول المناسبة لتعقيم دبوس النسخ المتماثل.

قم بإزالة لوحة رئيسية لمجموعة PA14NR من الفريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر ، وضعها على ثلج جاف في قدر ثلج سعة 4 لتر. خذ اللوح الرئيسي 96 جيدا ليتم تكراره من الثلج الجاف وضعه على المقعد للسماح بالذوبان لفترة وجيزة. قم بمحاذاة اللوحة الرئيسية ولوحة الأجار مع إحداثيات A1 لكلا اللوحين في الزاوية اليسرى العليا.

حدد موضع الإحداثيات A1 على لوحة الأجار المستطيلة. لتعقيم دبابيس النسخ المتماثل ، اغمر المسامير في 250 مل من 0.3 إلى 0.5٪ هيبوكلوريت الصوديوم لمدة 30 ثانية. اضغط على المكرر قليلا لإزالة السوائل الزائدة واغمر المسامير في 250 مل من الماء المعقم فائق النقاء لمدة 10 ثوان ، متبوعا ب 250 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ لمدة 30 ثانية و 250 مل من الإيثانول بنسبة 95٪ لمدة دقيقتين.

بتعقيم دبابيس النسخ المتماثل باللهب عن طريق إمساك النسخ المتماثل بشكل عمودي على لهب موقد بنسن ، والاقتراب ببطء من اللهب حتى يشتعل الإيثانول ثم يسحبه على الفور من اللهب. سوف ينطفئ اللهب بمجرد احتراق كل الإيثانول. قم بتبريد المسامير عن طريق تثبيتها على صفيحة مستطيلة غير مستخدمة تحتوي على أجار LB معقم لمدة 30 ثانية.

أثناء تبريد دبابيس النسخ المتماثل ، قم بتسخين ختم الألمنيوم لفترة وجيزة من اللوح الرئيسي لمجموعة PA14NR بيدك ، ثم قشره بعناية ، مع التأكد من أن الختم لا ينمح اللوحة. استخدم الملقط لتقشير أي بقايا من ختم الألومنيوم. أدخل دبابيس النسخ المتماثل في اللوح الرئيسي ، وادفع النسخ المتماثل برفق وأرجحها في جميع الاتجاهات الأربعة للتأكد من أن المسامير تتلامس مع الثقافات البكتيرية المجمدة في كل من الآبار البالغ عددها 96.

انتبه إضافيا للآبار الموجودة في الحافة الخارجية للوحة عن طريق دفع دبابيس النسخ المتماثل ضد الثقافات المجمدة في الآبار الموجودة على حافة اللوحة. ضع دبابيس النسخ المتماثل برفق على سطح ألواح الأجار. حرك النسخ المتماثل بحركة دائرية طفيفة لتشكيل العديد من المروج التي تتراوح مساحتها من أربعة إلى خمسة ملليمترات تقريبا لكل سلالة متحولة.

قم بإغلاق اللوح الرئيسي لمجموعة PA14NR بختم جديد من الألومنيوم المعقم. استخدم أسطوانة لوحة للتأكد من أن كل بئر وحواف اللوحة محكمة الغلق تماما. أعد اللوح الرئيسي 96 جيدا لتجفيف الثلج.

بعد التعامل مع مجموعة PA14NR ، امسح جميع أسطح العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول. انقل لوحة الأجار المكررة إلى حاضنة 37 درجة مئوية واحتضانها طوال الليل. قبل البدء في هذا الإجراء ، تأكد من خلو غطاء التدفق الرقائقي من المعدات غير الضرورية وقم بتشغيل منفاخ غطاء المحرك لمدة لا تقل عن 10 دقائق.

امسح أسطح غطاء المحرك وأي أشياء موضوعة في الغطاء باستخدام 70٪ من الإيثانول. باستخدام ماصة إلكترونية سعة 50 إلى 1200 ميكرولتر 12 قناة ، املأ كل بئر من كتلة بئر عميقة 12 مليلتر ب 525 ميكرولتر من مرق سائل LB يحتوي على مضادات حيوية مناسبة. ثم أغلق كتلة البئر العميقة قبل إزالتها من غطاء التدفق الرقائقي.

بعد ذلك ، انقل كتلة البئر العميقة المملوءة بالوسائط إلى سطح طاولة ممسوح بالإيثانول. قم بإنشاء حقل معقم باستخدام موقد بنسن على سطح الطاولة ، وقم بإعداد حاويات مع الحلول المناسبة لتعقيم دبوس النسخ المتماثل. اغمر دبابيس النسخ المتماثل في كل محلول كما هو موضح سابقا.

تعقيم اللهب دبابيس النسخ المتماثل. ثم قم بتبريد المسامير عن طريق التثبيت في صفيحة مستطيلة غير مستخدمة تحتوي على LB أجار لمدة 30 ثانية. ضع دبابيس النسخ المتماثل برفق على صفيحة الأجار التي تحتوي على سلالات متحولة مزروعة ، وتأكد من أن المسامير على اتصال بجميع الطفرات البالغ عددها 96 على لوحة الأجار.

ثم اغمر المسامير في الآبار العميقة التي تحتوي على مرق سائل LB لمدة خمس إلى 10 ثوان. تجنب لمس جوانب الآبار بالمسامير. أغلق كتلة البئر العميقة بغشاء مانع للتسرب معقم قابل للتنفس.

استخدم أسطوانة لوحة للتأكد من أن كل بئر فردي مغلق بشكل صحيح. امسح جميع أسطح العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول بعد التعامل مع مجموعة PA14NR. قم بزراعة المزارع السائلة الملقحة في شاكر عالي السرعة عند 37 درجة مئوية و 950 دورة في الدقيقة لمدة 15 إلى 16 ساعة.

ابدأ بتنظيف غطاء التدفق الرقائقي ، وتشغيل منفاخ غطاء المحرك لمدة لا تقل عن 10 دقائق. امسح جميع أسطح غطاء المحرك وأي أشياء موضوعة في الغطاء بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بإزالة 96 لوحا جيدا من الغلاف البلاستيكي.

انزع ملصق اللوحة لكل لوحة وضعه على طول حافة اللوحة الأقرب إلى الآبار A1 إلى H1 للوحة الوجهة. ارفع غطاء لوحة الوجهة قليلا وضع الملصق على الحافة السفلية لعرض الملصق عندما تكون اللوحة مغطاة بغطاء. قم بإزالة كتلة البئر العميقة من شاكر السرعة العالية ، وانقل الكتلة إلى غطاء التدفق الصفحي المعقم.

قم بإزالة غشاء الختم القابل للتنفس بعناية واستبدله بختم من الألومنيوم. قم بتدوير كتلة البئر العميقة بسرعة منخفضة جدا لجمع التكثيف. نظرا لأن نقل المزارع إلى لوحات الوجهة يمثل أكبر خطر للتلوث المحتمل بين الآبار ، فمن الأهمية بمكان اتباع جميع الإجراءات بعناية للحفاظ على العقم.

أعد كتلة البئر العميقة إلى غطاء المحرك المعقم. باستخدام ماصة إلكترونية سعة 50 إلى 1200 ميكرولتر من 12 قناة وأطراف معقمة مفلترة ، أضف 525 ميكرولترا من مزيج مرق الجلسرين السائل LB إلى كل بئر. امزج عن طريق سحب 300 ميكرولتر برفق لأعلى ولأسفل ثلاث مرات باستخدام ماصة إلكترونية.

المس الأطراف على جانب الآبار ، قبل حقن الأطراف لمنع التنقيط. أعد تحميل الماصة بأطراف جديدة معقمة مفلترة، واملأ الصف التالي من الآبار بمزيج مرق الجلسرين السائل LB. بعد ملء جميع الآبار بمزيج المرق السائل LB الجلسرين ، استخدم الماصة الإلكترونية ذات 12 قناة والنصائح المفلترة لسحب 900 ميكرولتر من مزيج ثقافة الجلسرين الطافرة من كل صف من كتلة البئر العميقة ، وتوزيع 150 ميكرولترا في آبار الصف المقابل في لوحات الوجهة لإنشاء ست نسخ من لوحة المكتبة.

استخدم ختم الألمنيوم المعقم لتغطية كل 96 لوحة وجهة بئر ، واستخدم أسطوانة لوحة لإغلاق حواف اللوحة وجميع الآبار تماما. تأكد من عدم تغطية معرف الملصق بختم الألومنيوم. قم بإزالة الألواح محكمة الغلق من الشفاط وضعها على سطح مستو متساو في فريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر.

امسح جميع أسطح العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول بعد التعامل مع المكتبة. باستخدام البروتوكول الموضح في هذا الفيديو ، تم تكرار 12 نسخة من مجموعة PA14NR بما في ذلك لوحات التحكم التي تتكون من آبار ملقحة من نوع البئر PA14 وغير ملقحة في نمط محدد مسبقا. تم فحص لوحات التحكم بصريا بعد النسخ المتماثل على ألواح أجار LB لضمان وجود أنماط النمو المتوقعة.

تم اختيار 38 سلالة متحولة بشكل عشوائي من إحدى النسخ التي تم إنشاؤها حديثا من مجموعة PA14NR ، وتم إجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات تعسفية لتأكيد هوية طفرات الينقولات. أكد التسلسل اللاحق لشظايا الحمض النووي الهوية المتحولة ل 35 من أصل 38 طفرة تم اختبارها. بمجرد إتقانها ، يستغرق النسخ المتماثل للمكتبة بأكملها حوالي 80 ساعة.

أثناء استخدام هذا البروتوكول ، من المهم أن تضع في اعتبارك عقم منطقة العمل في جميع الأوقات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء نسخ عالية الجودة من مجموعة P14NR أو مكتبات بكتيرية أخرى. لا تنس أن العمل مع Pseudomonas يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما ارتداء معدات الحماية الشخصية أثناء تنفيذ هذا البروتوكول.

يحافظ هذا البروتوكول على مكتبة Pseudomonas aeruginosa PA14 غير الزائدة عن الحاجة والتي لا تزال مصدرا مهما ، ليس فقط للفحص عالي الإنتاجية ، ولكن أيضا كمصدر للطفرات الفردية في معظم جينات Pseudomonas aeruginosa.